研究背景乳腺癌是全球女性最为常见的恶性肿瘤之一,它也是女性患者中死亡率最高的癌症类型。我国每年的女性乳腺癌新诊断病例数约占全世界的12.2%,因乳腺癌而死亡的女性患者约占全世界的9.6%。研究乳腺癌发生发展的分子生物学机制,寻求安全有效的治疗方法是临床医学工作者和基础医学研究人员迫切需要解决的问题。近年来,随着人们对“乳腺癌是一种全身性疾病”这一观点的普遍接受,集手术治疗、放疗、化疗、内分泌治疗、中医药治疗、生物治疗、靶向治疗等为一体的综合性治疗体系逐渐形成。随着肿瘤学临床研究和基础研究的进展,乳腺癌的各种疗法无论在安全性还是在治疗效果上都有所改进,但近年来全球乳腺癌的发病率和死亡率仍在逐步上升,在临床应用中也存在诸多问题,例如价格昂贵、耐药性的产生及全身毒副作用等。因此寻求一种毒副作用小、耐药性低且安全有效的药物应用于乳腺癌的临床治疗是亟待解决的问题。中药作为一种来源于药用草本植物的天然药物及其加工代用品,因其毒性相对较低、价格相对适中、疗效确切等优点引起了医学工作者的广泛关注,逐渐成为乳腺癌系统性辅助治疗中的重要组成部分。一些中药制剂在癌症的治疗中可以增强患者对其他疗法的敏感性,延长患者的生存期,提高机体免疫力及生活质量,有良好的临床应用前景。槐耳是一种生长在树干上的棕褐色药用真菌,在我国应用于疾病治疗已经有一千六百余年的历史。有越来越多的证据表明,槐耳在乳腺癌、结直肠癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、卵巢癌等多种癌症类型中有良好的治疗作用。我们团队在前期研究中证实了槐耳清膏可以通过抑制乳腺癌细胞增殖及转移、抑制肿瘤血管新生、诱导乳腺癌细胞凋亡及自嗜、调节肿瘤特异性免疫等多种机制发挥抗癌作用。对槐耳抗癌疗效分子机制的研究发现,槐耳对p53通路、pAKT/mTOR/S6通路、JNK/P38 信号通路、ER/NF-κB 通路、Wnt/β-catenin 通路、PI3K/AKT 通路等重要的信号通路都有调控作用。然而,槐耳潜在治疗机制还有待进一步的研究。长链非编码RNA(lncRNA)是一类由200个以上核苷酸组成的RNA分子。LncRNA虽然不具备蛋白质编码功能,但可以通过转录调节、转录后调节、表观遗传学修饰等多种方式对基因的表达进行调控,从而对多种人类疾病的发生发展产生影响。近年来lncRNA在癌症发生发展中的重要作用已被大量研究所证实,为lncRNA在临床诊断和靶向治疗中的应用奠定了基础。例如在前列腺癌中高特异性表达的新型前列腺癌抗原3(PCA3,又称DD3),是最早发现的与癌症相关的lncRNA之一,现已作为前列腺癌辅助诊断的生物标记分子应用于临床。因此对lncRNA在癌症中发挥的调节作用及机制的研究具有重要意义。目前还没有对lncRNA是否在槐耳的抗肿瘤功能中起介导作用的报道,因此我们从lncRNA入手探索槐耳抗癌作用的潜在机制,利用分子生物学技术,阐述槐耳清膏对乳腺癌细胞抑制作用的可能机制,为槐耳治疗乳腺癌提供药理学依据。研究目的1.探讨经槐耳处理与未处理的乳腺癌细胞,利用基因芯片分析两组细胞系中差异表达的基因;2.探讨lncRNA-H19在槐耳的抗癌疗效中发挥的作用和潜在的分子机制。研究方法1.细胞培养本研究中使用的MDA-MB-231、MDA-MB-468和MCF-7乳腺癌细胞系均培养在含10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基中,置于37℃、5%CO2环境中培养,2-3天传一次代。2.差异基因的分析本研究中,我们利用接受与未接受槐耳处理的乳腺癌细胞提取总RNA,然后反转成cDNA,送至Affymetrix公司进行芯片杂交处理。我们利用该公司提供的专业分析软件,分析该公司提供的原始数据,利用倍数法分析槐耳组和未接受槐耳组细胞系中差异表达的基因。3.基因功能显著性分析(GO分析):将分析出的差异表达的基因与GO数据库进行对比,并对每个基因的功能进行注释,最终得到每个基因所参与的功能,基于每个GO功能中发生变化的基因数目以及Fisher检验差异显著性的p值,挑选出变化最为显著的20个GO功能,并绘制G0功能的分布图。4.差异基因参与的信号通路分析(Pathway分析)利用公司提供的专业软件,基于KEGG信号通路数据库,将每个基因所参与的信号传导通路进行注释。基于每个Pathway中发生变化的基因数目以及Fisher检验差异显著性的p值,挑选出变化最为显著的20个Pathway,并绘制Pathway的分布图。5.差异基因所参与通路的网络分析根据上述结果所示的差异基因及其所参与的通路注释,利用专业的分析软件,绘制差异通路的网络图。其中红色代表通路激活,蓝色代表通路抑制,黄色代表通路中的基因既有上调也有下调。6.实时定量PCR(qPCR)我们利用Trizol处理乳腺癌细胞,提取总RNA,然后利用购买的反转录试剂盒将RNA反转成cDNA或microRNA,进行实时定量PCR(qPCR)实验,分别检测了槐耳提取物对lncRNA-H19和miR-675-5p表达水平的影响。7.质粒扩增提纯我们将lncRNA-H19的cDNA克隆至pcDNA3.1载体的多克隆位点,获得lncRNA-H19的过表达质粒。将适量质粒转化至感受态的大肠杆菌,将其涂布到含氨苄抗生素的LB培养板上,过夜培养12-16h。挑取培养板上的单克隆菌落置于含氨苄抗生素的LB培养液中进行培养使菌落扩增,过夜培养12-16h。利用购买的无内毒素质粒大提试剂盒进行质粒的提取。8.细胞转染将扩增提纯的lncRNA-H19过表达质粒、找生物技术公司合成的lncRNA-H19的siRNA或miR-675-5p的mimics和inhibitor,与一定量的脂质体2000混合,按照操作程序加至细胞中,调控相应基因的表达量,以进行后续的功能与机制研究。9.MTT实验将经过细胞转染的乳腺癌细胞种到7个96孔细胞培养板中,分别经槐耳处理0,1,2,3,4,5,6天后,向细胞中加入MTT溶液,利用酶标仪读取490nm处的吸光度值,从而检测过表达或抑制lncRNA-H19和miR-675-5p对乳腺癌细胞槐耳提取物敏感性的影响。10.流式细胞术将经过转染和槐耳处理的细胞进行Annexin V-FITC/PI染色,利用流式细胞仪检测凋亡细胞的比例,从而检测过表达或抑制lncRNA-H19和miR-675-5p是否对槐耳提取物诱导乳腺癌细胞凋亡的能力产生影响。11.Western Blot按照操作程序将细胞裂解,提取细胞总蛋白。然后进行SDS-PAGE电泳,随后进行转膜、封闭、一抗孵育及二抗孵育处理,最后利用化学发光试剂显示miR-675-5p的下游蛋白CBL的表达量以确定其是否在槐耳的抑癌功能中发挥介导作用。研究结果1.我们的结果显示,在经过8mg/ml槐耳溶液刺激72h后,共有1116个lncRNAs发生了显著的变化。其中有211个lncRNAs发生了上调,905个发生了下调。2.G0分析显示,在经过槐耳刺激后,共有129个主要的G0功能发生了变化,其中77个功能发生了上调,52个G0功能发生下调;Pathway分析显示,共有109个pathway发生了显著改变,其中有59个发生了上调,50个发生了下调;我们利用芯片数据构建了槐耳作用的分子通路图。3.槐耳提取物可以降低lncRNA-H19和miR-675-5p的表达,过表达LncRNA-H19和miR-675-5p可以抑制槐耳提取物的细胞毒作用。4.lncRNA-H19和miR-675-5p表达水平的降低可以促进槐耳提取物的抑癌作用,增加乳腺癌细胞对槐耳提取物的敏感性。5.槐耳提取物处理乳腺癌细胞后能上调miR-675-5p下游蛋白CBL的表达水平。结论1.槐耳具有多靶点的作用方式,可以通过抑制细胞周期进展、促进细胞凋亡等多种途径影响乳腺癌的发生与发展。2.槐耳可以对lncRNA的表达产生调控作用,槐耳可以通过lncRNA-H19/miR-675-5p/CBL途径抑制乳腺癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡。意义本研究从lncRNA的层面阐明了槐耳抗肿瘤功能的崭新机制,进一步证实了槐耳在乳腺癌中的治疗作用,并为其应用于临床治疗提供了理论依据。