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一、研究背景目前,我国约有2.9亿人患有心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）,并且由于急性冠脉综合征（Acute coronary syndrome,ACS）的高发病率,CVD的死亡率也越来越高,是人类主要的死亡原因之一。急性心肌梗死（Acute myocardial infarction,AMI）是由冠状动脉血流急性减少或完全中断,心肌出现持续性的缺血、缺氧,继而导致局部心肌细胞坏死,是ACS的典型表现。现阶段,心血管疾病的初级预防和治疗手段已取得重大进展,AMI后30天死亡率在过去20年中虽有所下降,然而其作为各种急性和亚急性疾病的常见并发症,仍然是全球疾病中的第一杀手。AMI属中医学“心痛”、“胸痹”、“真心痛”等范畴,张仲景在《金匮要略》中首次对“胸痹”进行专门论述:“夫脉当取太过不及,阳微阴弦,即胸痹而痛,所以然者,责其极虚也。今阳虚知在上焦,所以胸痹心痛者,以其阴弦故也。”认为“阳微阴弦”是本病的病机。大量流行病学研究围绕AMI的中医证候特点及演变规律展开,根据现有研究和中医学认识,AMI病性以本虚标实为主,气虚、血瘀的病理状态贯穿冠心病病机始终。因此,在辨证论治原则的指导下,治法与治则结合,AMI往往以气虚血瘀为基本病机,益气活血是其主要治法。导师以多年临床经验为研究基础,以益气活血为主要遣方原则的稳心汤是治疗AMI的有效方剂,其组成如下:黄芪15 g,党参15 g,姜黄9g,莪术9g,赤芍15g,肉桂3g,川芎10g,大黄6g,瓜蒌12g,细辛3 g,甘草6 g,其作用机制待进一步研究。miRNA是一类长度约为22个核苷酸、内源性的非编码RNA,通过与信使RNA（mRNA）上的互补序列相结合,阻断信息翻译成蛋白质,在心脏的发育、生理和病理等过程发挥重要作用。由于miRNA的极高稳定性及在血液样本中的易检性,目前已作为生物标志物广泛应用于急性心梗、先天性心脏病、扩心病等多种心血管疾病的研究中。同时,通过调控miRNA表达水平,可以从细胞凋亡、心肌纤维化、炎症反应等方面发挥防治心血管疾病的作用,是近年来研究的热点。miR-126-5p是miR-126家族成员之一,在冠心病心绞痛、多支病变、SYNTAX高评分患者中表达水平显著降低,在缺血/再灌注损伤的心肌细胞中也呈现过低表达,其高水平表达能够抑制动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）及左室肥厚。Bcl-2基因是一种原癌基因,它具有抑制凋亡的作用,Bcl-2家族蛋白是调节细胞凋亡与自噬平衡的关键分子,是细胞凋亡线粒体途径的关键调节因素。在正常情况下,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase）以无活性酶原形式存在于活细胞中,一旦收到凋亡诱导信号刺激时,Caspase就被激活,引发Caspase级联反应介导细胞凋亡。当心肌细胞胞浆内的Bcl-2受到各种调控的刺激后,抑制线粒体通透性转化孔的过度开放,从而降低Caspase的活性,抑制心肌细胞凋亡。miR-126-5p作为调控心肌细胞凋亡的潜在靶点,可能与靶向调控Bcl-2表达有关。课题组前期利用稳心汤干预不稳定性心绞痛患者,发现稳心汤能上调不稳定性心绞痛患者miR-126-5p和Bcl-212（Bcl-2家族成员）表达水平,与Caspase-9、Caspase-3表达呈负相关。因此,本研究拟制备大鼠急性心肌梗死模型,观察稳心汤对miR-126-5p/Bcl-2/Caspase-9/Caspase-3调控网络的影响,探讨其抑制心肌细胞凋亡的可能分子机制。二、研究目的观察稳心汤对急性心肌梗死大鼠的心功能、心肌组织病理形态学、基质金属蛋白酶（Matrixmetalloproteinase,MMP）和 miR-126-5p/Bcl-2 通路的影响,探讨稳心汤抑制心梗后心肌细胞凋亡的作用机制,进一步阐明益气活血理论的科学内涵。三、研究方法120只成年雄性Wistar大鼠行冠状动脉左前降支（Left anterior descending coronary artery,LAD）结扎术制备大鼠急性心肌梗死模型,随机分为模型组、盐酸曲美他嗪组、稳心汤低剂量组、中剂量组和高剂量组,另设假手术组,LAD仅穿线不结扎,各组连续灌胃给药28天。采用超声心动图检测左室射血分数（Left ventricular ejection fraction,LVEF）、左室短轴缩短率（Left ventricular fraction shortening,LVFS）、左室舒张末期内径（Left ventricular internal dimension diastole,LVIDd）和左室收缩末期内径（Left ventricular internal dimension systole,LVIDs）,观察心功能水平和心脏结构变化。称取大鼠体重（Body mass,BM）和左心室质量（Left ventricular mass,LVM）,计算左心室质量指数（Left ventricular mass index,LVMI）。HE染色观察心肌组织病理改变,Masson染色和胶原容积分数（Collagen volume fraction,CVF）检测大鼠心肌组织胶原的表达。酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达情况,实时荧光定量PCR法检测miR-126-5p、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3 表达水平,Western blot 法检测 MMP-2、MMP-9、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3等蛋白表达水平。四、研究结果（1）与假手术组相比,模型组大鼠LVEF、LVFS明显降低（P<0.05）,LVIDd、LVIDs显著增大（P<0.05）;与模型组相比,盐酸曲美他嗪组和稳心汤组LVEF、LVFS显著增高（P<0.05）,LVIDd、LVIDs显著降低（P<0.05）;稳心汤三组间比较,稳心汤中剂量组、高剂量组LVEF显著升高,稳心汤高剂量组LVFS显著增高,稳心汤高剂量组LVIDd显著降低,稳心汤中剂量组、高剂量组LVIDs显著减小（P<0.05）。（2）与假手术组相比,模型组LVMI明显升高（P<0.05）;与模型组相比,盐酸曲美他嗪组和稳心汤组LVMI显著减小（P<0.05）;稳心汤低剂量组、中剂量组LVMI均减小,但差异无统计学意义（P>0.05）。（3）与假手术组相比,HE染色观察到模型组心肌纤维明显断裂,散乱排列,着色深浅不一,细胞间隙增宽,盐酸曲美他嗪组和稳心汤组细胞排列较整齐,着色较均匀;Masson染色可见模型组心梗后心肌组织大量胶原沉积,与假手术组相比,CVF显著升高（P<0.05）,盐酸曲美他嗪组和稳心汤组胶原沉积明显减少,CVF均降低（P<0.05）;与稳心汤低剂量组相比,稳心汤中剂量组、高剂量组CVF显著降低（P<0.05）。（4）与假手术组相比,模型组大鼠血清中TNF-α表达水平升高（P<0.05）;与模型组相比,盐酸曲美他嗪组和稳心汤组大鼠血清中TNF-α表达水平均显著降低（P<0.05）;稳心汤低剂量组、中剂量组、高剂量组三组间无显著差异（P>0.05）。（5）与假手术组相比,模型组大鼠心梗后心肌组织中miR-126-5p表达显著减少（P<0.05）,Bcl-2 基因表达也呈下降趋势（P<0.05）,Caspase-9、Caspase-3基因表达增加（P<0.05）,同时,Bcl-2蛋白表达减少（P<0.05）,Caspase-9、Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达增加（P<0.05）;与模型组相比,盐酸曲美他嗪组和稳心汤组心梗后心肌组织中miR-126-5p表达均显著增加（P<0.05）,Bcl-2基因表达呈上升趋势（P<0.05）,Caspase-9、Caspase-3基因表达减少（P<0.05）,同时,Bcl-2 蛋白表达增加（P<0.05）,Caspase-9、Caspase-3、MMP-2、MMP-9蛋白表达减少（P<0.05）;其中,稳心汤低剂量组、中剂量组、高剂量组三组间比较,稳心汤高剂量组miR-126-5p和Bcl-2基因表达显著上调（P<0.05）,稳心汤组三组间Caspase-9、Caspase-3基因表达无显著差异（P>0.05）,稳心汤高剂量组Bcl-2蛋白表达显著增加（P<0.05）,Caspase-9、Caspase-3蛋白表达无显著差异（P>0.05）,稳心汤高剂量组MMP-2、MMP-9蛋白表达显著减少（P<0.05）。五、研究结论心肌梗死后心肌组织中miR-126-5p表达呈现显著降低的特征,具有益气活血作用的稳心汤能改善急性心梗大鼠的心功能、抑制心肌纤维化、心室重构、改善MMPs代谢,其机制可能与上调miR-126-5p表达,并调控其下游凋亡通路Bcl-2/Caspase-9/Caspase-3的基因和蛋白表达有关。