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背景高脂饮食引起的肥胖对男性激素的生成和生育能力有不利影响。肥胖可引起下丘脑-垂体-性腺轴功能失调,引起组织慢性炎症,而睾丸微环境的变化可导致睾丸Leydig细胞功能的失调,引起男性性腺功能减退,从而导致男性不育。研究表明,褪黑素具有调节情绪、体重、睡眠、免疫、抗氧化及昼夜节律等多种生理功能,但对男性生殖的作用有待进一步研究。目的研究高脂饮食对小鼠的睾丸Leydig细胞睾酮合成能力的损害,以及褪黑素通过抑制睾丸组织氧化应激和内质网应激发挥保护作用的机理,并从体外诱导TM3细胞氧化应激,进一步研究褪黑素保护作用的机制,从而阐明褪黑素对高脂饮食小鼠睾丸Leydig细胞功能的保护作用机制。方法24只C57BL/6J雄性小鼠随机分为3组:普通饲料组(CTRL);高脂饲料组(HFD);高脂饲料+褪黑素组(HFD+MT)。12周后测体重、血脂、激素及取材。HE染色法和免疫组化法(IHC)观察睾丸形态学变化;qRT-PCR法和Western blot法检测睾酮合成、氧化应激(OS)及内质网应激(ER stress)相关指标的表达。另将TM3细胞分CTRL组、H202组及MT+H202组进行培养,以H202诱导OS后,用CCK8法检测细胞活率、流式细胞术检测活性氧族(ROS),收集细胞后用Western blot法检测睾酮合成、氧化应激、内质网应激以及线粒体功能相关蛋白表达的变化。结果1.褪黑素对三组小鼠体重、血脂和激素的影响:三组小鼠中,HFD组体重、附睾组织重量、总甘油三酯(TG)较CTRL组增加,而HFD+MT组较HFD组下降(P<0.05);三组睾丸组织称重差异无统计学意义。与CTRL组相比,HFD组睾酮(T)、黄体生成素(LH)合成的水平下调,而HFD+MT组较HFD组上调(P<0.05)。2.三组小鼠睾丸组织的形态学观察:HE染色的结果显示,CTRL组小鼠睾丸组织结构完整,精原细胞和精母细胞呈圆形,排列整齐;睾丸间质细胞明显,呈多边形,细胞界限清晰,胞质丰富。而HFD组相较于CTRL组,睾丸间质细胞变小,形态不规则,胞质减少;生精细胞变为多边形,细胞排列不整齐。HFD+MT组和HFD组相比,细胞形态和排列有所恢复,接近正常形态。免疫组化(IHC)结果显示HFD组3β-HSD MOD明显低于对照组(P<0.05),而HFD+MT组3β-HSD MOD明显高于HFD组(P<0.01)。3.褪黑素对高脂饮食小鼠睾丸睾酮生成的保护作用:Western blotting结果显示,HFD组小鼠睾丸StAR和P450scc的表达水平显著低于CTRL组,而HFD+MT组较HFD组相比有所上调(P<0.05);qRT-PCR结果显示:与CTRL组相比,HFD组中Star,P450scc和Hsd17b的表达下调,而HFD+MT组较HFD组相比其表达上调(P<0.05)。4.褪黑素可抑制高脂饮食小鼠睾丸组织的氧化应激和内质网应激:Western blotting结果显示,HFD组中SIRT1和SOD2的表达显著低于CTRL组,而HFD+MT组与HFD组相比其表达上调。HFD组GRP78的表达显著高于CTRL组,而HFD+MT组低于HFD组(P<0.05)。qRT-PCR结果显示,HFD组中Sod2和Gpx4的mRNA表达低于CTRL组,HFD+MT组较HFD组有所增加。HFD组Grp78和Chop的mRNA表达高于CTRL组,而HFD+MT组Chop的mRNA表达较HFD组明显降低(P<0.05)。5.褪黑素对H2O2诱导的TM3细胞功能损伤的保护作用:为进一步探索褪黑素对损伤的Leydig细胞保护作用的机制,采用体外培养TM3细胞,用H2O2诱导OS,检测褪黑素对其功能的保护作用。CCK8检测结果显示,H2O2组与CTRL组相比,细胞活率降低,而MT+H2O2组较H202组升高(P<0.05)。流式细胞术的检测结果显示,与CTRL组相比,H2O2组TM3细胞的ROS水平增加,而MT+H2O2组较H2O2组ROS水平显著降低(P<0.05)。Western blotting结果显示,H2O2组睾酮生成蛋白/酶StAR的表达较CTRL组下调,而MT+H2O2组的表达较H2O2组上调(P<0.05);与CTRL组相比,H2O2组中氧化应激相关靶标SIRT1,SOD2和GPx4的表达较CTRL组下调,而MT+H2O2组与H2O2组相比其表达上调;H202组内质网应激蛋白GRP78的表达高于CTRL组,而MT+H2O2组较H2O2组其表达降低(P<0.05);CHOP的蛋白表达没有显著趋势(P>0.05)。TM3细胞中H2O2组线粒体功能相关靶标COX IV和CytC的表达与CTRL组相比有所下调,而MT+H2O2组较H2O2组的表达有所上调(P<0.05)。结论褪黑素通可以改善高脂饮食导致的小鼠Leydig细胞功能失调,减轻H2O2诱导的氧化应激对TM3细胞的损伤,对临床高脂饮食导致的男性性腺功能减退有潜在的治疗价值。