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目的冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease,CAD)患者心外膜脂肪组织(epicardial adipose tissue,EAT)中炎症因子的表达水平较非冠心病(non-CAD)患者明显升高,并且CAD组EAT中的免疫细胞以促炎的M1型巨噬细胞为主。EAT炎症是导致CAD发展的因素之一,但是调控EAT炎症应答的具体机制不清楚。本研究通过CAD患者EAT中差异表达的microRNA(miRNA)-3614以及体外培养THP-1巨噬细胞的基础上,探讨miR-3614对THP-1巨噬细胞炎症应答的影响,阐述miR-3614调控EAT炎症的分子机制,为治疗CAD提供新的治疗靶点。方法1.选取CAD和non-CAD组患者各30例,收集EAT及相关的临床生化指标。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测miR-3614、TNF受体相关因子6(TRAF6)、toll样受体4(TLR4)和P65的表达水平;2.THP-1细胞诱导分化为THP-1巨噬细胞,流式细胞术检测细胞表面标志物CD80和CD86阳性细胞的比例;3.LPS在不同浓度、不同时间点刺激体外培养的THP-1巨噬细胞,应用细胞转染和RNA干扰技术,分别上调、下调miR-3614和沉默TRAF6在THP-1巨噬细胞内的表达,qRT-PCR和Western blot检测细胞中miR-3614、TRAF6、IL-6、TNF-α、MAPKs和NF-κB炎症信号通路重要因子的表达水平,ELISA检测细胞上清液中炎症因子的表达水平,双萤光素酶报告实验检测miR-3614与TRAF6 3’UTR是否具有靶向结合的关系。结果1.人体组织实验(1)受试个体一般临床资料、血脂及血浆炎症因子水平比较CAD组IL-6、TNF-α和IL-1β水平显著高于non-CAD组,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)受试个体EAT中miR-3614、TRAF6和炎症信号通路关键因子mRNA及蛋白表达水平CAD组miR-3614的mRNA表达水平显著低于non-CAD组(P<0.0001)。CAD组TRAF6的mRNA和蛋白表达水平显著高于non-CAD组,及TLR4和P65的mRNA也显著高于non-CAD组(P<0.05)。(3)miR-3614表达与炎症信号通路关键因子表达相关性分析CAD组EAT中miR-3614的mRNA表达水平与TRAF6、TLR4和P65显著负相关(P<0.05)。2.体外细胞实验(1)THP-1细胞的培养及诱导分化为巨噬细胞未诱导分化的THP-1细胞为悬浮细胞,细胞形态呈圆形;经过诱导分化后细胞为贴壁细胞,细胞呈梭形,有触角生成。诱导分化后,流式细胞术检测细胞表面标志物CD80阳性细胞的百分比为88.2%,CD86阳性细胞的百分比为86.1%,CD80和CD86双阳性细胞的百分比为93.9%,说明成功将THP-1细胞诱导分化为THP-1巨噬细胞。(2)LPS刺激THP-1巨噬细胞后miR-3614和TRAF6的表达在相同时间内,用不同浓度的LPS刺激THP-1巨噬细胞,与LPS浓度为0 ng/ml相比,miR-3614的mRNA表达水平随LPS浓度的增加而降低,在1000 ng/ml时显著降低(P<0.05)。LPS浓度为1000 ng/ml时,在不同时间点刺激THP-1巨噬细胞,与0 min相比,miR-3614的mRNA表达水平随LPS刺激时间的增加而降低,在30 min时显著降低(P<0.05),但是TRAF6的mRNA和蛋白表达水平却显著升高(P<0.05)。(3)检测miR-3614调控下游炎症因子的产生THP-1巨噬细胞转染miR-3614 mimics后,以其相对应的对照组相比,miR-3614的mRNA表达水平显著升高,炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著降低,并且TRAF6的mRNA和蛋白表达水平也显著降低(P<0.05)。转染miR-3614 inhibitor后,miR-3614的mRNA表达水平显著降低,炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著升高,并且TRAF6的mRNA和蛋白表达水平也显著升高(P<0.05)。(4)miR-3614直接作用于TRAF6将野生型(WT)TRAF6 3’UTR质粒和NC或者miR-3614 mimics分别转染293T细胞,24小时后检测荧光素酶活性的改变,以其相对应的对照组相比,细胞内的荧光素酶活性显著降低(P<0.01)。(5)miR-3614负向调节THP-1巨噬细胞中LPS诱导促炎细胞因子的产生THP-1巨噬细胞转染miR-3614 mimics后,再用LPS刺激细胞,以其相对应的对照组相比,炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著降低(P<0.05),TRAF6的蛋白表达水平显著降低。THP-1巨噬细胞转染miR-3614 inhibitor后,再用LPS刺激细胞,以其相对应的对照组相比,炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著升高(P<0.05),TRAF6的蛋白表达水平显著升高。(6)miR-3614抑制LPS诱导的MAPKs和NF-κB炎症信号通路的激活THP-1巨噬细胞转染miR-3614 mimics后,再用LPS刺激细胞,细胞内的p-P38、p-JNK、p-ERK1/2、p-P65和p-IκBα和P65蛋白表达水平显著低于miR-3614 NC组(P<0.05)。(7)抑制TRAF6的表达降低LPS诱导的炎症反应抑制TRAF6的表达后,TRAF6的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。下抑制TRAF6的表达后,再用LPS刺激THP-1巨噬细胞,炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05)。结论(1)与non-CAD组患者相比,CAD组患者EAT中miR-3614低表达,且miR-3614的表达受炎症刺激的调节;(2)miR-3614可能通过靶向EAT中巨噬细胞的TRAF6/MAPKs/NF-κB途径来调控炎症的释放,防止过度的炎症反应。