应激(stress)是机体受到各种有害刺激后产生的非特异性适应反应，应激对机体的影响常呈双向性:对机体既有有利的一面，如动员机体非特异性的适应系统，提高对疾病的抵抗能力;也有不利的一面，如反应不适当会导致不同程度的心理或生理障碍，甚至引起躯体疾病。大量研究表明，机体处于应激状态时，可以引起一系列神经生化、内分泌和免疫系统的变化，影响机体内环境的稳定，引起器官功能的改变。应激对认知功能的影响更是极为复杂，目前大多研究认为慢性应激可使学习与记忆功能受损，但也有研究发现慢性应激可增强动物的学习与记忆能力。　　海马（hippocampus）因形如海中鱼类海马而得名，是许多神经科学家特别感兴趣的结构。海马与学习、记忆、情绪等高级功能活动具有密切关系。海马是一个具有可塑性的脑区，包括结构及功能的可塑性，其中结构可塑性是功能可塑性的基础。海马是介导应激反应最重要的脑区之一，也是应激作用的主要靶区。应激反应时，体内应激激素分泌增加，其中主要是糖皮质激素(glucocorticoid，GC)水平的升高。由于海马脑区富含糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor，GR)，并且是中枢神经系统中GR含量最高的部分，所以，应激反应时，高水平的GC会选择性地作用于海马，对其产生影响。海马的齿状回(dentate gyrus，DG)是一个特殊的区域，在成年动物，DG仍然存在着神经干细胞和神经发生活动，海马的神经发生受生理与病理因素的调控。　　以往在研究应激对海马结构和功能的影响时，通常采用的是单一应激原，即捆绑、电击、致痛、强迫游泳、睡眠剥夺或噪音等中的一种来制作动物模型，这无法模拟人类所面临的各种复杂的生存环境。课题组在前期研究中同时使用由4种应激原组成的“复合应激”来观察其对大鼠学习记忆成绩及突触后膜致密物质(PSD)表达的影响。研究结果提示慢性复合应激可增强大鼠学习与记忆成绩，多种突触后膜致密物质表达增加，同时发现大鼠海马各区神经细胞密度均有所增加。这些增加的细胞从何而来？是神经元还是神经胶质细胞？其机理如何？基于上述问题，设计了如下实验。本实验分为三个部分:　　第一部分:这一部分选择了两种新生细胞的标记物——BrdU(5-bromo-2-deoxyu-ridine)和Doublecortin(DCX)，旨在研究经历慢性复合应激后动物海马新生细胞和新生神经元的表达情况，以从新的角度证实在前期实验中所发现的慢性复合应激后海马各区细胞密度增加这一结果。　　在动物模型的制作上，延续了研究小组历时已三年的慢性复合应激模式:即将成年雄性Wistar大鼠随机分为对照组及慢性复合应激组，后者采用垂直旋转、睡眠剥夺、捆绑和夜间光照4种应激原无规律交替刺激长动物达6周。应激试验前，两组动物均用Morris水迷宫(Morris Water Maze，MWM)进行连续3d的学习与记忆成绩测试，应激试验结束后，两组动物再次进行3d的MWM测试。而后进行如下实验:①注射BrdU后，采用免疫细胞化学的方法比较两组动物海马DG新生细胞的计数。②观察新生神经元表达:运用免疫细胞化学方法观察海马DG新生神经元计数的变化，同时运用Westem-blot和RT-PCR技术分别检测DCX蛋白及其mRNA水平在海马组织中表达的变化。③观察细胞凋亡:用TUNEL法标记凋亡细胞，比较两组动物海马各区(CA1、CA3、DG)的细胞凋亡情况。　　以上实验结果显示:与对照组相比，①经历慢性复合应激后，动物的学习与记忆成绩优于对照组（P＜0.05）;②慢性复合应激组大鼠海马DG的Brdu阳性细胞计数显著增加(P＜0.05);③慢性复合应激组动物海马DG新生神经元计数明显增多;海马DCX蛋白和DCX mRNA转录水平均明显上调(P＜0.05);④慢性复合应激组海马各区细胞凋亡数目明显增加(P＜0.05)。　　上述结果提示:慢性复合应激致大鼠的学习与记忆能力增强并促进海马DG区神经发生，我们推测新生神经元数量增加是导致大鼠学习记忆能力增强的原因之一。　　第二部分:在第一部分研究中，发现慢性复合应激可以增强成年大鼠海马DG神经发生。是什么因素导致了这些变化呢？慢性复合应激有没有可能促进一些神经发生的相关因子的表达呢？为了证实我们的推测，这一部分我们制备了慢性复合应激后大鼠海马提取液，并采用侧脑室注射的方法，观察其对成年雄性大鼠学习与记忆成绩和海马齿状回神经发生的影响，以期从一定水平阐明慢性复合应激增强大鼠学习与记忆功能及神经发生的机制。　　按照第一部分描述制作应激动物模型后，我们分别制备了对照组和应激组动物海马提取液，进行成年大鼠侧脑室注射，分别简称为注对组和注应组，而注射人工脑脊液的为对照组。各组动物均注射BrdU，在MWM测试学习和记忆成绩后，三组动物分别进行了如下实验:①观察标记BrdU细胞:采用免疫细胞化学方法比较三组动物海马DG新生细胞的计数。②观察新生神经元表达:运用免疫细胞方法观察海马DG区新生神经元计数的变化。③观察细胞凋亡:用TUNEL法标记凋亡细胞，比较三组动物海马各区(CA1、CA3、DG)的细胞凋亡情况。　　以上实验结果显示:①与对照组相比，注对组动物学习记忆成绩明显提高(P＜0.05);②与对照组相比，注对组和注应组动物海马DG的BrdU阳性细胞计数均明显增加（P＜0.05;P＜0.01）;③与对照组相比，注对组和注应组动物海马DG新生神经元计数明显增多(P＜0.05;P＜0.01);与对照组相比，注应海马DG新生神经元数明显增多（P＜0.05）;④三组动物海马各区凋亡细胞数目未见明显差异(P＞0.05)。　　以上结果提示:慢性复合应激大鼠海马提取液可增强大鼠学习与记忆成绩，并促进大鼠海马的神经发生，慢性复合应激可能促使了一些神经营养因子的合成与释放，从而对海马的功能起促进作用。　　第三部分:研究慢性复合应激后海马提取液对海马原代培养细胞的影响，以证实慢性复合应激可能增加神经发生相关因子表达这一推测。　　制作应激动物模型后，分别制备对照组和应激组海马提取液，分别加入到海马原代细胞培养皿中，分别简称为对提组和应提组，而仅加入无血清培养基的为对照组。处理一周后，测定各组细胞神经元的纯度，并分别进行如下实验:①激光共聚焦技术检测海马神经元内钙离子浓度。②分别采用免疫细胞化学和Westem-blot技术检测海马培养细胞DCX的表达情况。　　以上实验结果显示:①与对照组相比，应提组海马原代培养细胞内钙离子浓度明显下降（P＜0.05）;②与对照组相比，对提组和应提组DCX免疫反应产物的光密度值明显增加（P＜0.05）;③与对照组相比，对提组和应提组DCX蛋白表达水平明显上调(P＜0.05，P＜0.01);与对提组相比，应提组细胞DCX蛋白表达水平明显上调(P＜0.05)。　　以上结果提示:慢性复合应激大鼠海马提取液可促进海马原代培养细胞的生长，并降低细胞内钙离子浓度，提示慢性复合应激可以促使一些神经营养因子的合成与释放，这些因子有利于海马内环境的稳定，促进海马的神经发生，并且对海马的学习、记忆等功能起到积极影响。