第一部分NF-KB通路影响前列腺癌进展的研究背景前列腺癌(prostate cancer, PCa)是发生于前列腺上皮的恶性肿瘤,在老年男性中最常见。世界范围内,前列腺癌发病率位于男性所有恶性肿瘤的第二位,死亡率居第六位。我国前列腺癌发病率相对较低,但近年来其发病率逐渐增高。多项研究提示慢性炎症在包括前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生和发展过程中扮演重要作用。巨噬细胞(Macrophage)是肿瘤微环境中重要的炎症细胞,可通过多种途径调节肿瘤的发展。有研究发现巨噬细胞和肿瘤细胞间的直接交流可导致肿瘤细胞向外扩散并进入血液系统,因此巨噬细胞被认为是肿瘤微环境中的关键因素。因肿瘤细胞易发生突变,定位于肿瘤细胞的药物常导致肿瘤出现耐药性,疗效欠佳；巨噬细胞相对稳定,因此被认为是肿瘤治疗的潜在重要靶点。然而,巨噬细胞在前列腺癌发展转移过程中扮演的作用和其调节机制仍不明确。核转绿因子(Nuclear factor-kappaB, NF-κB)被认为是炎症和免疫反应的重要调节因素。研究证实NF-κB在多种恶性肿瘤中处于异常激活状态,而抑制NF-κB的活性可抑制多种肿瘤的进展,提示NF-κB在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。此外,有研究发现NF-κB是肿瘤相关巨噬细胞(TAM)中重要的整合肿瘤微环境信号的调节分子。通过特殊方法去除TAM中NF-κB的作用,可显著抑制肿瘤的发展,表明NF-κB是肿瘤微环境中调节肿瘤进展的重要信号通路,可作为治疗恶性肿瘤的一个潜在靶点。生长抑素类似物(Somatostatin dextran70, smsDX)是生长抑素(somatostatin-14)的糖基化产物,可以与5个生长抑素受体(SSTR1-5)结合,具有广泛的生物学活性。我们前期研究发现smsDX可调节X连锁凋亡抑制蛋白相关因子1 (XAF1)诱导前列腺癌的凋亡,并且能调控线粒体相关蛋白抑制前列腺癌的进展,表明其抗前列腺癌潜能。此外有研究发现生长抑素可以降低T淋巴细胞干扰素的分泌,从而限制巨噬细胞的转移、吞噬和存活能力,从而发挥抗炎作用。然而,smsDX能否抑制炎性肿瘤微环境中前列腺癌的进展尚不明确。目的本研究分别以三种常见的前列腺癌细胞株(LNCaP,DU145,PC-3)和巨噬细胞为模型,构建共培养体系,观察巨噬细胞对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响；评估smsDX对巨噬细胞刺激的前列腺癌细胞增殖、侵袭能力的抑制作用。明确NF-κB在前列腺癌发展过程中的作用,并探讨smsDX对前列腺癌中NF-κB可能的调节作用。为研究激活肿瘤微环境somatostatin-NF-KB途径抑制晚期前列腺癌发展提供理论基础。方法PMA刺激THP-1细胞获得巨噬细胞,将巨噬细胞上清液单独或加入smsDX,分别与LNCaP, DU145, PC-3细胞混合培养。用细胞活力试验(CCK-8 assays)和克隆形成实验(Clony formation assay)检测前列腺癌细胞增殖的变化。通过细胞划痕(Scratch migration assay)和Trans well迁移侵袭试验(Transwell migration and invasion assay)评估前列腺癌细胞迁移侵袭能力的变化。用裸鼠荷瘤实验观察smsDX和巨噬细胞对前列腺癌细胞体内增殖的影响,并检测裸鼠皮下肿瘤中CD68和NF-κB蛋白的表达情况。通过免疫组化技术(Immunohistochemistry)分别检测前列腺增生,慢性前列腺炎和前列腺癌组织标本中CD68和NF-κB蛋白的表达情况,评估巨噬细胞浸润数量与NF-κB表达的关系。运用免疫印迹技术(Western blot)和免疫荧光(Immunofluorescence)评估NF-κB的蛋白表达和核转位情况。结果通过CCK-8和克隆形成实验检测细胞活力变化,我们发现巨噬细胞可显著促进前列腺癌细胞体外的增殖和克隆形成,而smsDX可减弱巨噬细胞刺激的前列腺癌细胞增殖和克隆形成的变化。细胞划痕和Traswell实验表明巨噬细胞增强了前列腺癌细胞体外的迁移侵袭能力,而smsDX可抑制这种作用。我们进一步通过裸鼠荷瘤实验发现巨噬细胞同样能促进前列腺癌细胞裸鼠皮下的增殖,而smsDX可以明显抑制裸鼠皮下的肿瘤体积。检测不同前列腺疾病组织标本中巨噬细胞的浸润与NF-κB的表达,我们发现前列腺癌和慢性前列腺炎组织标本中存在较多巨噬细胞浸润,巨噬细胞的浸润数量与NF-κB的激活有一定相关性。进一步检测巨噬细胞和smsDX分别作用后前列腺癌细胞中NF-κB的表达,我们发现巨噬细胞可上调NF-κB在前列腺癌细胞核中的表达,同时伴随胞浆中NF-κB下调：smsDX作用则抑制了NF-κB在细胞核和胞浆中的变化。免疫荧光实验进一步证实smsDX可以抑制巨噬细胞诱导的前列腺癌细胞中NF-κB的核转位。结论巨噬细胞能够激活NF-κB促进前列腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭,smsDX通过NF-κB途径抑制肿瘤微环境中巨噬细胞对前列腺癌的刺激作用。我们的研究为smsDX作为联合治疗前列腺癌中的辅助用药提供了理论基础。研究创新通过本课题研究,加深了肿瘤微环境中TAM对前列腺癌进展影响的认识,进一步验证了NF-κB在前列腺癌进展过程中的重要作用。抑制NF-κ3途径可减弱巨噬细胞对前列腺癌的刺激作用,为治疗前列腺癌提供了新的思路。第二部分AKT-mTOR通路对前列腺癌进展的影响背景前列腺癌是老年男性常见的恶性肿瘤,发病率居我国男性肿瘤第七位。在临床上,早期前列腺癌为雄激素依赖性肿瘤,对内分泌治疗有良好的反应,但许多患者在接受内分泌治疗后1-3年内,逐步进展为雄激素非依赖性前列腺癌(Androgen-independent prostate cancer, AIPC)。此时患者多发生骨骼等远处转移,对雄激素去势治疗敏感性下降,目前无其它有效治疗措施,5年生存率仅为29%。研究发现约70%晚期前列腺癌患者存在骨转移灶,而骨骼等远处转移是导致前列腺癌预后不良的重要原因。近年来醋酸阿比特龙和狄诺塞麦(Denosumab)等新兴药物被证明对晚期前列腺癌有一定疗效,但是这些药物有效率不高,且高昂的花费在一定程度限制了其在我国的临床应用。因此我们试图寻找一些价格低廉但有效的药物治疗晚期前列腺癌。PI3K-AKT-mTOR通路调控多种肿瘤细胞的增殖,凋亡和侵袭转移等生物学行为。有研究发现该通路在原发性前列腺癌中有42%表达上调,而在转移性前列腺癌中则高达100%。抑制该通路可有效抑制前列腺癌的增殖转移。这表明PI3K-AKT-mTOR在前列腺癌发展过程中发挥重要作用,抑制该通路可作为治疗前列腺癌的一个潜在靶目标。中药黄芩是从唇形科植物黄芩的干燥根中提取的一种成分。现在药理研究发现,黄芩具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤的功能。黄芩素(Baicalein)是黄芩的一种活性成分,大量研究发现,黄芩素能够抑制肝细胞癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、乳腺癌和直肠癌细胞的增殖、侵袭,诱导肿瘤细胞发生凋亡。上述研究表明黄芩素具有广泛的抗肿瘤活性。但目前黄芩素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞生物学的影响未见报道。黄芩素能否通过PI3K-AKT-mTOR通路抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导肿瘤细胞凋亡尚未明确。因此在本课题第二部分,我们深入研究了黄芩素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞侵袭转移和凋亡的影响,并探讨PI3K-AKT-mTOR通路的重要作用。目的本研究以雄激素非依赖性前列腺癌细胞株DU145和PC-3细胞为模型,观察了黄芩素对DU145和PC-3细胞活力、凋亡、迁移和侵袭的影响。评估了黄芩素处理后,DU145和PC-3细胞中凋亡相关蛋白的变化,并检测了黄芩素对前列腺癌细胞中caveolin-1, AKT口mTOR表达的影响。我们结果阐明了前列腺癌细胞中caveolin-1/AKT/mTOR信号途径在黄芩素调节的前列腺癌生物学行为中的作用。方法运用细胞活力检测实验评估不同浓度黄芩素作用不同时间对DU145和PC-3细胞增殖的影响,确定黄芩素最佳作用浓度和时间。将DU145和PC-3分别与20和40μM黄芩素作用48小时,用流式细胞凋亡检测实验(Flow cytometric apoptosis assays)评估黄芩素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞凋亡的诱导作用。分别运用划痕实验和Transwell迁移侵袭实验检测不同浓度黄芩素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞迁移和侵袭的影响。进行免疫印迹实验,检测黄芩素对DU145和PC-3细胞中凋亡相关蛋白(Bax, Bcl-2, PARP和survivin)和caveolin-1,AKT,mTOR表达的影响。随后分别用黄芩素和LY294002 (PI3K抑制剂)处理两株细胞,观察细胞中Bax和Bcl-2的表达变化,进一步评估两株细胞活力和侵袭变化。结果体外实验表明,黄芩素能够显著抑制DU145和PC-3细胞的增殖,并且抑制作用具有浓度和时间依赖性。细胞划痕试验结果表明,黄芩素可以抑制前列腺癌细胞的横向迁移,且具有浓度依赖性。Transwell试验进一步验证了黄芩素对前列腺癌细胞迁移的抑制,并且表明黄芩素能够显著抑制前列腺癌细胞的侵袭,其抑制作用同样具有浓度依赖性。通过流式细胞技术检测发现黄芩素可以诱导DU145和PC-3细胞的凋亡,并且具有浓度依赖性。20和40μM黄芩素使DU145和PC-3细胞凋亡数分别增加了0.83、1.82倍和0.24、1.13倍。表明与PC-3细胞相比,DU145对黄芩素诱导的细胞凋亡更加敏感。检测黄芩素处理后前列腺癌细胞中凋亡相关蛋白表达发现,黄芩素可以上调Bax、PARP蛋白表达,而下调Bcl-2、survivi n。我们进一步探讨黄芩素调节前列腺癌生物学行为的分子机制,发现黄芩素可下调两株细胞中caveolin-1、p-AKT和p-mTOR的表达,而总AKT和总mTOR表达不受影响。给予PI3K抑制剂LY294002,可以增强黄芩素促进的Bax上调,而使Bcl-2下调更加明显；而CCK-8和Transwell试验表明ⅠY294002可以降低DU145和PC-3细胞的活力和侵袭能力,并能够增强黄芩素对DU145和PC-3细胞增殖和侵袭的抑制作用。结论黄芩素通过caveolin-1/AKT/mTOR通路诱导雄激素非依赖性前列腺癌细胞凋亡,抑制其增殖,迁移和侵袭。黄芩素对前列腺癌进展的抑制作用,为黄芩素的抗肿瘤活性提供了新的有力证据,为治疗晚期前列腺癌提供了新的策略。研究意义本研究提示中药黄芩素对前列腺癌发展的抑制作用,为我们进一步检验中药治疗前列腺癌提供了理论基础。对雄激素非依赖性前列腺癌细胞增殖、转移的抑制和凋亡的诱导,为治疗前列腺癌提供了新的潜在或辅助用药。