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嗜血支原体（Hemotropic Mycoplasma,Hemoplasma）是一类不能在体外培养、半径小、具有多种形态、无细胞壁的细菌,寄生于动物红细胞表面、血浆及骨髓内。先前归类于血巴通氏体属（Haemobartonella spp.）和附红细胞体属（Eperythrozoon spp.）,目前基于16S rRNA基因序列分析重新归于嗜血支原体属（Hemotropic Mycoplasma）。嗜血支原体感染可引起多种宿主不同程度的溶血性贫血、黄疸、劳动力下降、生育繁殖障碍和体重减轻等症状,但感染的成年宿主死亡率很低。嗜血支原体寄生宿主范围广泛,可感染家畜（禽）、伴侣动物、野生动物和人。随着越来越多的嗜血支原体临床病例的报道,给许多国家的畜牧业发展都带来了损失。然而,关于羊嗜血支原体（Hemoplasmas（Mycoplasma ovis and‘Candidatus Mycoplasma haemovis’））的分子流行病学研究较少,且‘Candidatus M.haemovis’这种嗜血支原体分离株/种/变异体鲜有报道,迄今为止在中国还未被检测到。为了解我国部分地区羊嗜血支原体流行情况,本试验建立了灵敏度好、特异性强的羊嗜血支原体巢式PCR检测方法,为该病原的快速检测提供了技术方法。使用建立的巢式PCR方法对我国部分地区羊嗜血支原体感染情况进行调查,并对得到的阳性样品进行序列比对和遗传进化分析,为了解我国部分地区羊嗜血支原体分子流行病学及其遗传进化特征提供了理论依据。1.羊嗜血支原体巢式PCR检测方法的建立与应用为了建立一种灵敏度高、特异性强的羊嗜血支原体检测方法,根据GenBank上发表的M.ovis（登录号:AF338268）和‘Candidatus M.haemovis’16S rRNA基因序列（登录号:AB617737）,设计内、外2对特异性引物,建立了巢式PCR检测方法。优化该方法的最佳反应体系与条件,并进行了特异性、敏感性、重复性试验及临床样本检测。结果表明,该方法能扩增出大小为506 bp（M.ovis）或489 bp（‘Candidatus M.haemovis’）的羊嗜血支原体特异性片段,与GenBank收录的相关参考序列同源性高达97.8%99.6%;与猪嗜血支原体（Mycoplasma suis）、嗜吞噬细胞无浆体（Anaplasma phagocytophilum）、绵羊无浆体（Anaplasma ovis）、莫氏巴贝斯虫（Babesia motasi）、吕氏泰勒虫（Theileria luwenshuni）基因组DNA均无交叉反应;DNA最低检测量为0.654 fg·μL-1;具有良好的重复性;对77份羊临床血液样品检测结果表明,羊嗜血支原体阳性率为71.4%,均高于常规PCR和已报道的巢式PCR检测结果。2.羊嗜血支原体分子流行病学研究为了解我国部分地区羊嗜血支原体分子流行情况,自河南、内蒙古、云南、贵州、陕西等8个省（市、自治区）采集绵羊（504）和山羊（860）血液样品,采用所建立的巢式PCR方法特异性扩增羊嗜血支原体16S rRNA基因片段。结果显示,总体阳性率为44.7%（610/1364）。山羊阳性率为44.1%（379/860）,绵羊阳性率为45.8%（231/504）,不同品种的阳性率差异不显著;小于1岁羊阳性率为45.6%（205/450）,大于1岁羊阳性率为44.3%（405/914）,不同年龄阳性率差异不显著。然而,放牧羊阳性率54.4%（396/728）显著高于舍饲羊阳性率33.6%（214/636）,不同饲养模式下阳性率差异显著;公羊阳性率60.0%（138/230）明显高于母羊阳性率41.6%（472/1134）,不同性别羊阳性率差异显著。以上结果表明我国羊嗜血支原体分布广泛,总体阳性率较高。3.羊嗜血支原体遗传进化研究将研究得到的610份嗜血支原体阳性样品,应用常规PCR方法扩增1341 bp的16S rRNA基因序列,挑选出不同农场不同采样地点具有代表性的103条16S rRNA基因序列,应用Clustal X 2.1软件进行序列比对与拼接,用MegAlign和Mega 6.06软件分别进行同源性分析及构建系统进化树。结果表明,103条Hemoplasmas 16S rRNA基因序列中56条为M.ovis,47条为‘Candidatus M.haemovis’,比对后得到4种有碱基差异的基因序列（GenBank登录号分别为KU983740,KU983746,KU983748和KU983749）;在构建的系统进化树中M.ovis和‘Candidatus M.haemovis’出现在同一大分支上,且二者的16S rRNA基因序列的同源性为97.3%97.5%,表明二者可能为同一个种16S rRNA基因的不同拷贝;此外,本研究得到的M.ovis（KU98374和KU983746）序列与人源M.ovis（GU230144和KF313922）分离株位于同一进化分支上,且同源性高达99.8%99.9%,该结果表明M.ovis具有潜在的人兽共患风险及公共卫生学意义。