论文部分内容阅读
背景:恶性肿瘤已经成为威胁全球人民生命安全的主要疾病,恶性肿瘤具有较高的发生率和病死率,早期诊断、早期治疗是降低恶性肿瘤病死率的关键。在恶性肿瘤的诊断中,医学影像学的检查不可或缺,其中超声因实时动态、安全性高、成本低及易于操作等优点在临床应用愈加广泛。尤其是随着超声造影（Contrast-enhanced ultrasound,CEUS）技术的出现更是提高了超声成像的能力,提升了超声在疾病诊疗中的作用,但目前临床应用的超声造影剂属于血池造影剂,无法进入组织间隙,且尺寸大、半衰期短。故研发新型超声造影剂具有重要意义。在恶性肿瘤治疗方式的选择上,手术、放化疗、免疫等传统的治疗手段仍存在不可避免的局限性,新型治疗方式中声动力疗法（Sonodynamic Therapy,SDT）以其无创、无毒、深层组织穿透效应及靶向性等优点受到广泛关注。纳米材料在光、声、电、磁等方面具有优越的特性,使得其在声学成像和声动力治疗等领域被广泛研究。设计构建将诊断与治疗集于一体的纳米平台是近几年研究热点,对肿瘤的精准诊疗具有重要意义。在本研究中我们在对纳米材料进行研究设计后,得到一种集超声成像和声动力治疗为一体的新型声动力纳米材料并验证了其在超声成像方面优良的特性和其在肿瘤组织治疗方面的潜能。目的:设计合成一种声响应的金属-有机框架衍生的多孔碳纳米球（Porous carbon nanospheres,PCNS）,评估超声成像效果,并初步探究材料在声动力治疗肿瘤方面的应用效果。方法:1、纳米材料PCNS表征检测:用透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）对其形貌及元素组成进行分析,采用Malvern ZS90纳米粒度仪和zeta电位测定仪测试其流体力学直径,Brunauer-Emmett-Teller（BET）法获得PCNS的比表面积。2、采用电子自旋共振（ESR）光谱仪捕获超声激发下PCNS产生的单线态氧（~1O2）特征信号。3、纳米材料PCNS细胞相容性实验及体外细胞SDT疗效:采用小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）、人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人宫颈癌细胞（Hela）细胞系,对其进行培养、传代,将对数生长期的细胞与不同浓度材料共同孵育24 h后,细胞计数试剂盒-8（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测细胞存活率,评估材料的细胞相容性。以MDA-MB-231（人乳腺癌细胞株）作为靶细胞进行培养、传代,将对数生长期的细胞与不同浓度材料共同孵育24 h后进行低强度超声（2.5W/cm~2,1.0 MHz）照射10 min,通过CCK-8法检测细胞存活率。以未经照射的材料作为对照组,对其毒性进行评估。4、纳米材料PCNS细胞水平活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）产生能力检测:通过诱导典型探针2,7-二氯二氢荧光素二醋酸酯（DCFH-DA）来评估低强度超声波治疗仪（2.5 W/cm~2,1.0 MHz）照射不同浓度纳米粒子后细胞内ROS产生情况,荧光显微镜下观察荧光强度。5、纳米材料PCNS体外超声成像实验:将不同浓度纳米材料（3.13、6.25、12.5、25、50、100μg/m L）加入离心管内,采用美国DJO集团出品的2776型号超声波治疗仪用作激发源进行照射。通用电气公司购入的超声仪器,观察并记录各组超声的图像变化。6、纳米材料PCNS体内超声成像实验:向瘤内注入纳米粒子,采用体外成像实验中成像效果最佳时对应的材料浓度,超声造影模式下观察并记录超声图像的变化。7、荷瘤小鼠构建及纳米材料PCNS体内声动力治疗实验:荷瘤小鼠构建:取对数生长期MDA-MB-231（人乳腺癌细胞株）,胰酶消化,PBS稀释至1×10~7个/100μL,将100μL细胞混悬液注射到Balb/c雌性小鼠（n=9）腋下建立肿瘤模型,肿瘤体积达到100-150mm~3后进行后续实验操作;将9只荷瘤小鼠随机分为3组（n=3）,向组一瘤内注射PBS,组二和组三瘤内注射PCNS,并对组三进行低强度超声（2.5 W/cm~2,1.0 MHz）照射10 min。治疗14天后牺牲所有小鼠,取小鼠的主要器官（心、肝、脾、肺、肾）及肿瘤组织制成石蜡切片,采用苏木精-伊红（HE）染色进行组织病理学分析。结果:1、PCNS的水合流体力学直径约为150 nm,具有优异的稳定性,其比表面积高达1600 m~2/g。较大的比表面积和适宜的孔隙率保证其携带大量的气体,为超声成像提供了保障。2、电子自旋共振（ESR）谱的三重信号峰（1:1:1）明显增强,证明在超声波辐照下,PCNS可以产生~1O2。3、纳米材料PCNS的细胞相容性及体外细胞SDT疗效:该纳米材料生物相容性佳,不同浓度的PCNS与细胞共同孵育24 h,结果显示生存的细胞没有受到明显的影响,证实了在没有外部刺激下,PCNS本身对细胞几乎是无毒的。体外SDT肿瘤细胞结果显示:在PCNS和超声（Ultrasound,US）处理后,癌细胞存活率相比于未经US处理的对照组下降,且随着材料浓度的升高,细胞的存活率下降越明显。证实其良好的声动力疗效。4、ROS检测结果:经超声照射处理后的纳米材料,在荧光显微镜下观察到染色结果出现亮绿色荧光信号强度,且具有浓度依赖性,提示纳米材料PCNS在低强度的US刺激下可有效生成ROS,进一步说明其具有良好的声动力效应。5、体外超声成像实验显示:含有PCNS的PBS溶液具有明显的超声增强信号,这种对比度增强表现出明显的浓度依赖性,浓度越大,信号越明显。6、体内超声成像实验结果显示:在PCNS材料注入后,小鼠肿瘤部位超声造影信号逐渐开始增强,表明了PCNS具有CEUS的潜能。7、肿瘤HE染色结果显示PCNS+US处理后的肿瘤组织受到大量破坏。说明SDT起到了一定的治疗效果。各组主要器官（包括心、肝、脾、肺、肾）的HE染色显示可以忽略的组织形态学改变,说明PCNS在体内具有良好的生物相容性。结论:1、设计的新型纳米材料PCNS粒径均一合适、理化性质稳定、生物相容性佳、本身对细胞几乎无毒。2、PCNS在超声下可以成像,具有成为超声造影成像试剂的潜能。3、PCNS具有声响应性,在低强度超声照射下可以产生ROS来发挥SDT的效果,对肿瘤细胞及组织产生杀伤作用。