研究目的肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)的高发病率和高死亡率严重威胁着人类健康。大多数肝癌患者一经诊断即为晚期肝癌,没有手术切除的机会。而对于许多晚期肝癌患者,化疗是唯一的选择。但是,对化疗药物的耐药是肝癌治疗的主要障碍。到目前为止,肝癌的总体预后较差。因此,迫切需要找到新的分子靶标来抑制肝癌的进程并增强肝癌细胞对化疗药物的反应。核苷酸结合寡聚域(nucleotide-binding oligomerzation domain,NOD)蛋白NOD1和NOD2,是细胞内NOD样受体家族的经典成员,其可感知细菌肽聚糖中的保守基序并诱导促炎症反应和抗微生物反应。近期研究表明,许多固有免疫受体也参与了肿瘤进展的调控,这提示NOD1和NOD2可能在肿瘤进展中也发挥一定的调控作用。此外,研究表明,NOD1基因的改变与胃、结肠、肝和其他类型恶性肿瘤的风险改变有关;而NOD2基因多态性与淋巴瘤、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌和喉癌的风险增加有关。然而,NOD1和NOD2是否在肝癌发生与进展中发挥一定的调控效应至今尚不明确。本课题旨在探索NOD蛋白对肝癌发生与进展的作用效应及其对肝癌细胞化疗敏感性的调控效应,并进一步阐明其发挥作用的分子机制。本研究将为阐明肝癌疾病进展调控和肝癌细胞对化疗药物反应的分子机制提供新的线索,为肝癌的新型治疗策略的研究和开发提供新思路。第一部分NOD1对肝细胞肝癌的作用效应及分子机制材料方法1.检测NOD1对HCC疾病进展的调控作用1.1检测NOD1在肝癌临床标本中的表达水平应用120例肝癌及其对应的远端非癌肝组织的石蜡切片(其中30例病例中既包含肝癌、远端非癌肝组织,还包含非癌组织的交界部分),对NOD1分子进行免疫组织化学染色,检测其在肝癌细胞中的表达定位与表达水平。染色后应用IPP6.Plus图像分析软件进一步分析NOD1在肝癌组织及其配对的非癌肝组织中的表达差异。应用western blot法检测64例肝癌患者的肝癌组织及其配对非癌肝组织中NOD1蛋白的表达水平。应用Image J软件对肝癌组织及其对应的非癌肝组织中NOD1表达条带进行定量分析,并应用Graph Pad Prism5.0软件对条带灰度进行统计学分析。1.2构建裸鼠异种移植瘤模型,检测NOD1对HCC的调控作用将0.1ml 107个HUH7细胞皮下注射到裸鼠的腋下两侧。出现肉眼可见的肿瘤时,向左侧的肿瘤注射Myc-NOD1质粒,同时向右侧的肿瘤注射Myc-vector质粒。在第一次注射后第28天处死小鼠,并将肿瘤从小鼠的腋下两侧剥离以进行进一步分析。提取剥离肿瘤组织的蛋白质,应用western blot检测肿瘤组织内是否成功过表达NOD1。称取剥离肿瘤组织的重量,并测量肿瘤体积,比较分析实验组和对照组之间肿瘤重量和体积的差异。2.检测NOD1对HCC细胞增殖的调控效应2.1 NOD1表达受抑制细胞模型的构建与细胞增殖检测在肝癌细胞系HUH7和HepG2中分别转染NOD1特异性小干扰RNA(Si-NOD1),并以非特异性无义序列(Si-NC)转染组作为对照。Western blot筛选出两条干扰效率达80%以上的Si-NOD1序列,用于构建NOD1表达受抑制细胞模型。CCK-8法检测NOD1表达受抑制细胞模型细胞增殖能力的变化,并进一步检测NOD1表达受抑制细胞模型细胞克隆形成能力的变化。2.2 NOD1过表达细胞模型的构建与细胞增殖检测在肝癌细胞系HUH7和HepG2中分别转染Myc-NOD1质粒,并以Myc-vector质粒转染组作为对照。Western blot验证NOD1过表达细胞模型的成功构建。CCK-8法检测NOD1过表达细胞模型细胞增殖能力的变化,并进一步检测NOD1过表达细胞模型细胞克隆形成能力的变化。2.3检测NOD1对HCC细胞周期的调控应用流式细胞术检测干扰NOD1表达后,细胞周期的变化。应用PI染色法和BrdU染色法染色后,检测NOD1过表达后细胞周期的变化。应用western blot分别检测过表达NOD1及干扰NOD1表达后细胞周期P21、p-CyclinD、p-CyclinE等相关蛋白的表达变化。3.探索NOD1参与调控HCC进展的机制3.1筛选NOD1的分子靶点应用免疫共沉淀的方法检测包括P53、TSC1、P65、ERK、SRC、LKB1等在内的潜在的分子靶点是否与NOD1结合。由此筛选出SRC可能是NOD1的潜在作用靶点并进行后续研究。3.2检测NOD1与SRC的结合在HUH7细胞系中分别转染Myc-NOD1质粒和HA-SRC质粒,转染24h后,免疫荧光化学染色检测NOD1和SRC在细胞内是否存在共定位。应用体外翻译体系在体外合成NOD1蛋白和SRC蛋白,继而应用免疫共沉淀检测NOD1与SRC的结合是否为直接结合。分别构建SRC、NOD1各个结构域缺失的截断突变质粒,并应用免疫共沉淀的方法明确NOD1与SRC结合的具体结构域。3.3检测NOD1抑制HCC细胞增殖的信号转导通路Western blot检测NOD1过表达细胞模型和NOD1表达受抑制细胞模型中p-SRC和SRC的变化。将成功构建的NOD1表达受抑制细胞模型用SRC抑制剂(PP2,100nM)处理,应用western blot检测细胞周期相关蛋白P21、p-Cyclin D、p-Cyclin E等的变化,并进一步检测细胞克隆形成能力的变化。Western blot检测NOD1过表达细胞模型和NOD1表达受抑制细胞模型中SRC下游包括MAPK、STAT3、AKT等信号通路变化,以此筛选SRC参与调控的下游信号通路。在NOD1表达受抑制细胞模型中用ERK抑制剂(U0126,1μM)处理,应用western blot验证MAPK信号通路被成功抑制,继而检测细胞克隆形成能力的变化。在NOD1表达受抑制细胞模型中进一步干扰SRC的表达,western blot检测MAPK信号通路相关蛋白包括p-P38、p-JNK、p-ERK等的变化。提取剥离裸鼠肿瘤组织蛋白,western blot检测SRC-MAPK信号轴相关蛋白的变化。4.检测NOD1对HCC细胞化疗敏感性的调控作用4.1检测NOD1能否调控HCC细胞对5-FU的化疗敏感性在肝癌细胞系HepG2中转染Myc-NOD1质粒,并以Myc-vector质粒转染组作为对照,同时加入5-FU处理细胞,处理72h后,CCK-8法检测细胞活力的变化。在肝癌细胞系HepG2中转染Myc-NOD1质粒,同时加入5-FU处理细胞,24h后检测细胞活力的变化,应用CalcuSyn软件分析NOD1与5-FU是否存在协同效应。在肝癌细胞系HepG2中转染Myc-NOD1质粒,并以Myc-vector质粒转染组作为对照,同时加入5-FU处理细胞,24h后收蛋白,western blot检测SRC-MAPK信号轴相关蛋白的变化。将0.1 ml 1 × 107个HUH7细胞皮下注射于裸鼠腋下双侧,当肉眼可见肿瘤出现时,将肿瘤分为4组,分别为Myc-vector转染加PBS对照组、Myc-vector转染加5-FU(50 mg/kg)治疗组、Myc-NOD1转染加PBS治疗组,Myc-NOD1转染加5-FU(50mg/kg)治疗组。记录各组肿瘤的生长状态,并绘制生长曲线。在转染26天后处死小鼠并剥离肿瘤组织。称量各组肿瘤的质量,并测量各组肿瘤体积。提取肿瘤组织蛋白,western blot检测各组SRC-MAPK信号轴相关蛋白的变化。4.2检测NOD1能否调控HCC细胞对sorafeinib的化疗敏感性在肝癌细胞系HepG2和HUH7中分别转染Myc-NOD1质粒,并以Myc-vector质粒转染组作为对照,加入sorafeinib处理细胞48h后,CCK-8法检测细胞活力的变化。在肝癌细胞系HepG2和HUH7中转染Myc-NOD1质粒,加入sorafenib处理细胞,48h后检测细胞活力的变化,应用CalcuSyn软件分析NOD1与sorafeinib对于HCC细胞的作用效应。在肝癌细胞系HepG2和HUH7中分别转染Myc-NOD1质粒,并以Myc-vector质粒转染组作为对照,同时各组每隔48h加入10μM的sorafeinib,或等体积DMSO作为对照,10天后检测细胞克隆形成能力。在肝癌细胞系HepG2中分别转染Myc-NOD1质粒,并以Myc-vector质粒转染组作为对照。加入10μM的sorafeinib,或等体积DMSO作为对照,继续培养24h后收蛋白,western blot检测HCC细胞不同处理组SRC-MAPK信号轴相关蛋白的变化。实验结果1.NOD1有效抑制HCC进展1.1 NOD1在肝癌临床标本中的表达水平显著下调免疫组化结果显示,NOD1表达于HCC细胞的胞浆中,与配对非癌肝组织相比,NOD1在肝癌组织中的染色强度明显降低。Western blot结果也显示,与非癌肝组织相比,肝癌组织中NOD1蛋白表达显著下调。以上结果提示,NOD1在肝癌组织的表达水平显著下调,其缺失表达可能促进HCC的恶性进展。1.2 NOD1显著抑制裸鼠异种移植肿瘤的生长成功构建裸鼠异种肿瘤移植模型后,瘤内注射Myc-NOD1质粒,以Myc-vector质粒注射组作为对照。注射质粒28天后处死裸鼠,分离肿瘤,量取体积并称重。结果显示,与Myc-vector注射组相比,Myc-NOD1注射组的肿瘤体积及重量均显著降低;Western blot结果验证了 Myc-NOD1注射组内NOD1的成功过表达。以上结果提示,NOD1显著抑制裸鼠异种移植肿瘤的生长。综合以上结果提示,NOD 1参与调控HCC的进展。2.NOD1通过诱导细胞周期阻滞进而抑制HCC细胞的增殖2.1 NOD1显著抑制HCC细胞增殖成功干扰NOD1的表达后,HCC细胞的增殖能力和克隆形成能力均显著提高。反之,过表达NOD1后,HCC细胞的增殖能力和克隆形成能力均显著降低。2.2 NOD1通过调控细胞周期进程进而抑制HCC细胞增殖干扰NOD1的表达后,HCC细胞进入G2/M期的比例明显上调;反之,过表达NOD1后,HCC细胞阻滞在G1期的比例明显增加。在成功构建的NOD1过表达细胞模型中,与Myc-vector转染组相比,Myc-NOD1转染组HCC细胞的P21表达水平上调,p-Cyclin D,p-Cyclin E、p-CDC2及其原型的水平均明显下调;在成功构建的NOD1表达受抑制细胞模型中,与Si-NC转染组相比,Si-NOD1转染组HCC细胞的P21表达水平下调,p-Cyclin D及Cyclin D的蛋白水平下调。以上结果提示,NOD1通过上调P21使HCC细胞阻滞在G1期进而抑制细胞增殖。3.NOD1通过抑制SRC-MAPK信号轴抑制HCC疾病进展3.1 NOD1与SRC存在直接结合作用免疫共沉淀结果显示,在HCC细胞中,NOD1和SRC能够结合。免疫荧光结果显示,在HCC细胞中,NOD1和SRC共定位于细胞浆。体外翻译体系成功合成NOD1和SRC蛋白,进一步的免疫共沉淀结果显示NOD1与SRC的结合为直接结合。进一步免疫共沉淀结果显示,NOD1通过其CARD结构域与SRC的SH2结构域结合。以上结果提示,在HCC细胞系中NOD1与SRC直接结合。3.2 NOD1通过下调p-SRC的水平发挥其对HCC的抑制效应过表达NOD1后,HCC细胞中p-SRC水平显著下调,而SRC表达水平无变化;反之,抑制NOD1的表达后,HCC细胞中p-SRC水平显著上调,而SRC表达水平无变化。NOD1表达受抑制细胞模型用SRC抑制剂(PP2)处理后,p-SRC、P21、p-Cyclin E、p-CDC2、Cyclin E及CDC2的水平显著下调,而SRC的表达水平无变化;经SRC抑制剂PP2处理后,NOD1缺失表达细胞的克隆形成能力显著降低。以上结果提示,NOD1通过抑制SRC的活化发挥其对HCC的抑制效应。3.3 NOD1通过抑制SRC-MAPK信号轴抑制HCC进展过表达NOD1后,HCC细胞中p-P38,p-JNK以及p-ERK的水平均显著降低;而抑制NOD1的表达后,HCC细胞中MAPK信号通路分子的磷酸化水平显著提高。在NOD1表达受抑制细胞的细胞模型中,加入MAPK通路的抑制剂后,HCC细胞的克隆形成能力被有效逆转。以上结果均提示,NOD1通过抑制MAPK信号通路的活化抑制HCC的进展。在NOD1表达受抑制细胞模型中,应用Si-SRC干扰SRC的表达,western blot检测结果显示,MAPK信号通路的活化被有效抑制。裸鼠异种移植肿瘤提取蛋白,western blot检测结果显示,NOD1显著抑制SRC-MAPK信号通路活化。以上结果提示,NOD1通过抑制SRC-MAPK信号轴的活化发挥其对HCC的抑制效应。4.NOD1显著提高HCC细胞对化疗药物的敏感性4.1 NOD1显著提高HCC细胞对5-FU的敏感性药物敏感性实验表明,NOD1显著提高HCC细胞对5-FU的敏感性;进一步的实验结果表明NOD1能够协同促进5-FU对HCC的抑制效应。在成功构建的裸鼠异种移植肿瘤模型中,Myc-NOD1转染加5-FU处理组的肿瘤的生长速度最慢、肿瘤的体积最小且重量最轻。各组剥离出的肿瘤组织提取蛋白,western blot检测结果显示,NOD1通过抑制SRC-MAPK信号通路的活化提高HCC对5-FU的敏感性。4.2 NOD1显著提高HCC细胞对sorafenib的敏感性药物敏感性实验表明,NOD1显著提高HCC细胞对sorafenib的敏感性;进一步的研究表明NOD1能够协同促进sorafenib对HCC的抑制效应;此外,NOD1显著增强sorafenib对HCC细胞克隆形成能力的抑制效应。Western blot检测结果显示,NOD1通过抑制SRC-MAPK信号通路的活化提高HCC对sorafenib的敏感性。以上结果提示,NOD1通过抑制SRC-MAPK信号轴的活化显著提高HCC细胞对化疗药物的敏感性。第二部分NOD2对肝细胞肝癌进展的作用效应及分子机制材料方法1.小鼠体内实验检测NOD2对肝癌的作用效应1.1小鼠原位HCC肿瘤模型检测NOD2对HCC的作用效应NOD2-/-小鼠(n=7)和WT小鼠(n=8)在6周龄时注射DEN(100mg/kg,i.p.),随后每周注射CC14(0.5ml/kg,i.p.),共计12次。注射DEN后24周处死小鼠,并称量小鼠体重。分离肝脏、肠系膜、膈肌等脏器,拍照,量取肝脏肿瘤长径,留取各脏器相应组织,并制备HE切片。1.2裸鼠异种移植肿瘤模型检测NOD2对HCC的作用效应在裸鼠右侧皮下注射1×107HUH7细胞(n=15)。当肉眼可见肿瘤出现时,将小鼠随机分为三组。其中两组肿瘤(每组n=5)分别注射两种特异性靶向NOD2的siRNAs(Si-NOD2),另一组肿瘤(n=5)注射无义序列(Si-NC)作为对照。第一次转染后第38天处死小鼠,剥离肿瘤组织,量取肿瘤体积和质量,并对形成的肿瘤进行统计学分析。提取肿瘤组织的mRNA和蛋白质,应用qRT-PCR和western blot验证NOD2是否被成功抑制。裸鼠两侧皮下注射1×107HUH7细胞(n=11)。肉眼可见肿瘤出现时,左侧肿瘤注射Myc-NOD2质粒(20μg),右侧肿瘤注射Myc-vector质粒(20μg)。在第一次注射质粒21天后处死小鼠并分离肿瘤。剥离肿瘤组织,量取肿瘤体积和重量,并进行统计学分析。提取肿瘤组织的mRNA和蛋白质,应用qRT-PCR和western blot验证NOD2是否成功过表达。2.体外实验检测NOD2对HCC的作用效应应用western blot检测NOD2在HepG2和HUH7细胞系中的基础表达水平,筛选出NOD2相对高表达与相对低表达的细胞系,并进一步用NOD2相对高表达的细胞系构建NOD2表达受抑制的细胞模型,用NOD2相对低表达的细胞系构建NOD2过表达细胞模型。在HUH7细胞中分别转染三条靶向NOD2的siRNA(Si-NOD2),并以Si-NC转染组作为对照,筛选出两条干扰效率达80%以上的Si-NOD2,用于构建NOD2表达受抑制细胞模型;在成功构建的NOD2表达受抑制细胞模型中,通过CCK-8法和克隆形成实验检测干扰NOD2表达对HCC细胞增殖和克隆形成能力的影响;通过Transwell法检测干扰NOD2表达对HCC细胞侵袭转移能力的影响。在HepG2细胞中转染Myc-NOD2质粒,并以Myc-vector转染组作为对照。转染24h后,应用western blot验证NOD2是否成功过表达,以此判定NOD2过表达细胞模型构建是否成功。在成功构建的NOD2过表达细胞模型中,通过CCK-8法和克隆形成实验检测过表达NOD2对HCC细胞增殖和克隆形成能力的影响;通过Transwell法检测过表达NOD2对HCC细胞侵袭转移能力的影响。在HCC细胞中加入NOD2的配体胞壁酰二肽(MDP,10μg/ml)刺激,同时加入等体积MDP溶剂作为对照,应用CCK-8法检测细胞增殖能力的变化,应用Transwell法检测细胞侵袭能力的变化,应用克隆形成法检测细胞克隆形成能力的变化。3.临床标本中检测NOD2在HCC组织中的表达应用165例肝癌及其对应的远端非癌肝组织的石蜡切片,对NOD2分子进行免疫组织化学染色,检测其在肝癌细胞中的表达定位与表达水平。染色后应用IPP6.Plus图像分析软件进一步分析NOD2在肝癌组织及其配对非癌肝组织中的表达差异,并进一步分析NOD2的表达与肿瘤病理分期、分级等临床指标是否存在相关性。应用qRT-PCR和western blot检测64例HCC临床标本中NOD2的mRNA和蛋白表达水平。应用Image J软件对肝癌组织及其配对非癌肝组织中NOD2表达条带的灰度进行定量分析,并应用Graph Pad Prism5.0软件对条带灰度进行统计学分析。进一步分析NOD2的表达与肿瘤分化程度等临床指标是否存在相关性。4.检测NOD2在HCC中发挥效应的信号转导通路过表达或抑制NOD2表达后,应用western blot检测包括MAPK、AMPK、mTORC1、AKT、JAK-STAT3等相关信号通路的变化。应用western blot检测NOD2过表达细胞模型和NOD2表达受抑制细胞模型中AMPK通路及mTORC1通路相关分子的表达变化。将成功构建的NOD2过表达细胞模型用APMK信号通路抑制剂(Compound C,10μM)处理,应用 western blot 检测 AMPK-mTORC1信号通路相关蛋白的变化,同时检测细胞克隆形成能力和侵袭能力的变化。分别提取原位肝癌肿瘤模型肿瘤组织和裸鼠异种移植肿瘤模型肿瘤组织的蛋白,western blot检测AMPK-mTORC1信号通路相关蛋白的变化。5.检测NOD2对HCC细胞自噬及凋亡的影响应用western blot检测NOD2过表达细胞模型和NOD2表达受抑制细胞模型中ATG相关蛋白及LC3B-Ⅱ的表达变化。应用AnnexinV-PI染色后流式细胞术检测NOD2过表达细胞模型中凋亡细胞的比例。应用western blot检测NOD2过表达细胞模型和NOD2表达受抑制细胞模型中Caspase 9-Caspase 3内源性凋亡途径相关蛋白的表达变化。在成功构建的NOD2过表达细胞模型中转染Si-ATG5,以此抑制自噬的发生。转染48h后收蛋白,western blot检测LC3B-Ⅱ、剪切型Caspase 9及剪切型Caspase 3的表达变化。分别提取原位肝癌肿瘤模型肿瘤组织和裸鼠异种移植肿瘤模型肿瘤组织的蛋白,western blot检测自噬、凋亡信号通路相关蛋白的变化。6.检 NOD2对HCC细胞化疗敏感性的调控作用在肝癌细胞系HepG2中转染Myc-NOD1质粒,并以Myc-vector质粒转染组作为对照。分别加入sorafenib、lenvatinib或5-FU处理细胞48h后,CCK-8法检测细胞活力的变化。在成功构建的NOD2过表达细胞模型中加入sorafenib、lenvatinib或5-FU处理细胞,同时加入等体积DMSO作为对照,处理24h后收集细胞,应用AnnexinV-PI染色后流式细胞术检测细胞凋亡比例。在成功构建的NOD2过表达细胞模型中加入lenvatinib(5μM)或sorafenib(10μM)处理细胞,同时加入等体积DMSO作为对照,处理48h后收集并裂解蛋白,western blot 检测 p-AMPK、p-S6、LC3B-Ⅱ、Caspase 9、剪切型 Caspase 9、Caspase 3及剪切型Caspase 3的表达变化。7.探索NOD2调控AMPK信号通路的机制收集HUH7细胞并提取蛋白,应用免疫共沉淀的方法检测NOD2与内源性LKB1或AMPKα之间以及AMPKα与LKB1之间的相互结合。应用免疫荧光染色(Immunofluorescence,IF)的方法检测 NOD2 在 HCC 细胞中与 LKB1、AMPKα的共定位。应用体外蛋白翻译体系合成NOD2、LKB1和AMPKα蛋白,进一步用Co-IP实验检测NOD2与AMPKα或LKB1的直接结合作用。实验结果1.动物实验结果表明,NOD2对HCC发挥抑癌效应1.1小鼠原位HCC模型表明,NOD2表达缺失促进HCC发生在成功构建的DEN/CC14诱导的小鼠HCC模型中,与WT小鼠相比,NOD2-/-小鼠的肿瘤数量、肝体比和肿瘤直径均显著增加,而NOD2-/-小鼠的体重显著降低。HE染色显示,NOD2-/-小鼠的肿瘤与WT小鼠肿瘤相比,其肿瘤组织的分化程度显著降低。NOD2-/-小鼠在肠系膜和膈肌的转移位点比WT小鼠显著增加。以上结果提示,NOD2表达缺失显著促进HCC的发生。1.2裸鼠异种移植肿瘤模型表明,NOD2显著抑制HCC肿瘤的生长在成功构建的NOD2表达受抑制的裸鼠异种移植肿瘤模型中,与Si-NC转染组相比,Si-NOD2转染组肿瘤的体积和重量均显著增加。qRT-PCR和western blot分析显示,在转染Si-NOD2的组中成功敲除NOD2;反之,在成功构建的NOD2过表达裸鼠异种移植肿瘤模型中,与Myc-vector质粒转染组的肿瘤相比,Myc-NOD2质粒转染组的肿瘤和重量均显著降低。qRT-PCR和western blot检测证实NOD2在转染质粒组中NOD2的成功过度表达。以上结果提示,NOD2显著抑制裸鼠异种移植肿瘤的生长。2.细胞模型结果表明,NOD2抑制HCC的恶性行为NOD2在HUH7细胞中的相对表达量较高,因此HUH7在后续细胞实验中用于构建NOD2表达受抑制细胞模型;NOD2在HepG2细胞中的相对表达量较低,因此HepG2在后续细胞实验中用于构建NOD2过表达细胞模型。抑制NOD2的表达后,HCC细胞的增殖、侵袭和克隆形成等恶性行为能力均显著增强。反之,过NOD2显著抑制HCC细胞的增殖、侵袭和克隆形成等恶性行为能力。在HCC细胞用MDP激活NOD2同样显著抑制HCC细胞的增殖、侵袭和克隆形成等恶性行为。以上结果表明,NOD2能够抑制HCC的恶性行为。3.临床标本检测结果表明,NOD2表达缺失促进HCC的临床进展免疫组化分析显示,与配对的非癌肝组织相比,肝癌组织中NOD2的表达水平显著降低。进一步分析表明,肿瘤淋巴结转移(TNM)临床分期较晚期的HCC患者中,NOD2的表达显著降低。qRT-PCR和western blot分析显示,NOD2在HCC组织中的表达完全丢失或显著降低。统计分析表明,低分化的肝癌患者与高分化的肝癌患者相比,NOD2的表达水平明显降低。以上临床结果表明,肝癌患者NOD2表达的缺失显著促进HCC的恶性进展。4.NOD2通过激活AMPK信号通路发挥抑制HCC的效应NOD2表达受抑制细胞模型和NOD2过表达细胞模型均表明,NOD2通过激活AMPK信号通路抑制mTORC1信号通路的活化。进一步的研究发现,NOD2通过激活AMPK信号通路抑制HCC的恶性行为。体内实验进一步验证了 NOD2通过激活AMPK信号通路抑制mTORC1信号通路的活化,进而发挥其对HCC的抑制效应。以上结果表明,NOD2通过激活AMPK信号通路发挥其抑制HCC疾病进展的效应。5.NOD2通过诱导细胞自噬促进HCC细胞凋亡NOD2表达受抑制细胞模型和NOD2过表达细胞模型均表明,NOD2显著激活自噬信号通路,同时显著激活Caspase 9-Caspase 3内源性凋亡途径。进一步的研究发现,NOD2诱导HCC细胞凋亡是通过激活自噬所介导的。体内实验进一步表明,NOD2通过激活自噬诱导HCC细胞凋亡。以上结果提示,NOD2在HCC中通过激活自噬诱导细胞凋亡。6.NOD2显著增强5-FU、lenvatinib和sorafenib的化疗敏感性药物敏感性实验表明,NOD2能显著提高HCC细胞对5-FU、lenvatinib和sorafenib治疗的敏感性并显著促进5-FU、lenvatinib和sorafenib对肝癌细胞的治疗作用。此外,NOD2显著增加了经5-FU、lenvatinib和sorafenib治疗后HCC细胞的凋亡率。进一步的研究表明,NOD2通过激活AMPK-mTORC1信号通路继而诱导自噬介导的细胞凋亡,从而显著促进HCC细胞对sorafenib和lenvatinib的敏感性。以上结果表明,NOD2通过调节AMPK通路显著增强肝癌细胞的化疗敏感性。7.NOD2通过直接结合LKB1-AMPKα复合体激活AMPK信号通路在HCC细胞中的IP结果显示,NOD2可与内源性的LKB1和AMPKα蛋白结合,同时验证了 AMPKα和LKB1蛋白存在结合,提示NOD2/LKB1/AMPKα在细胞内形成复合体。免疫荧光结果表明,NOD2在HCC细胞的胞浆中与LKB1和AMPKα存在共定位。体外蛋白翻译实验进一步表明NOD2直接与LKB1和AMPKα相互作用。以上表明,NOD2通过直接与LKB1和AMPKα相互作用,从而在HCC细胞中形成NOD2-LKB1-AMPKα复合体进而直接激活AMPK通路。结论1.NOD蛋白在HCC临床标本中的表达量显著下调,且NOD蛋白在肝癌中的表达下调或缺失参与了 HCC的疾病进展。2.NOD蛋白作为固有免疫分子,在肝癌的疾病进展中发挥显著性的抑癌效应。3.NOD1通过直接结合SRC抑制HCC细胞中SRC-MAPK信号轴发挥其抑制HCC疾病进展及增强HCC细胞的化疗敏感性的作用。4.NOD2通过直接结合LKB1-AMPKα复合物激活HCC细胞中的AMPK信号通路发挥其抑制HCC疾病进展及增强HCC细胞化疗敏感性的作用。创新性和意义1.本课题首次报道,固有免疫分子NOD蛋白作为肿瘤抑制因子在HCC的进展中发挥抑癌效应,为HCC的临床诊断和治疗提供了新的分子生物学标记物和治疗靶点。2.本课题首次报道:NOD1通过直接结合SRC继而抑制SRC-MAPK信号轴的活化发挥对HCC的抑制效应;NOD2通过直接结合LKB1-AMPKα复合物激活AMPK信号通路继而促进HCC细胞发生自噬诱导的凋亡发挥其对HCC的抑癌效应,为阐明肝癌的进展机制和对其进行分子水平的有效调控奠定基础。3.本课题首次报道,NOD蛋白作为化疗调节剂增强HCC细胞对化疗药物的敏感性,为增强临床肝癌患者的治疗反应和改善预后奠定基础。