人鼻病毒3C蛋白酶(HRV 3C-P)是一种人鼻病毒编码的半胱氨酸蛋白酶。针对人鼻病毒3C蛋白酶的抑制剂是预防小RNA病毒感染的重要手段之一。同时,由于人鼻病毒3C蛋白酶具有高活性和高特异性等特点,可用于蛋白表达纯化过程中去除融合标签。因此,具有很高的工业、医用价值。病毒多肽链序列分析表明人鼻病毒3C蛋白酶可以特异性识别多肽序列LEVLFQ↓GP,并在Gln和Gly之间进行切割,然而对人鼻病毒3C蛋白酶的底物特异性缺乏深入的研究。针对这一问题,我们开发了一种基于酵母内质网滞留筛选系统(YESS)的能快速解析蛋白酶底物切割位点特异性的新方法(YESS-PSSC),来对人鼻病毒3C蛋白酶底物切割位点P1(Q)、P1’(G)、P2’(P)的特异性进行全面解析。YESS-PSSC方法省去了传统体外反应的蛋白质表达、纯化和体外反应条件探索,并且在酵母内质网滞留信号肽的帮助下能更加简捷、灵敏和精确对蛋白酶底物特异性进行解析。我们利用YESS-PSSC和传统的体外蛋白酶-底物测试方法分别对特异性不强的P2’位点的氨基酸特异性进行了解析。结果表明两种方法针对20种不同氨基酸底物的切割效率虽然有一定差异,但整体的趋势基本相符,证明了YESS-PSSC方法能有效替代传统的体外蛋白酶-底物测试方法。针对人鼻病毒3C蛋白酶底物切割位点P1(Q)、P1’(G)、P2’(P)的特异性的全面解析表明:人鼻病毒3C蛋白酶在P1位点不仅可以高效的识别原始的Gln,同样可以高效识别Glu,底物切割效率都达到96%以上;在P1’位点,人鼻病毒3C蛋白酶可以识别具有小侧链的氨基酸Gly、Ala、Cys和Ser,切割效率分别为98%、71%、76%和35%;而在P2’位点未显示出较强的氨基酸特异性。随后,我们结构模拟了人鼻病毒3C蛋白酶与各种底物突变体序列的对接结果,并结合生化分析发现蛋白酶在P1位点的识别特征主要由人鼻病毒3C蛋白酶的His160和Thr141与底物P1位点氨基酸间的相互作用决定。针对His160和Thr141两个位点的饱和突变分析表明:蛋白酶His160位点与底物P1位点氨基酸形成的氢键,是锚定底物P1位点氨基酸在S1活性口袋位置的主要作用力;而Thr141位点与底物P1位点氨基酸形成的两个氢键,稳定了底物P1位点氨基酸侧链的朝向,并维持了蛋白酶S1活性口袋的结构,对底物和酶的契合有重要作用。相比而言,人鼻病毒3C蛋白酶S1’活性口袋很小、刚性强,从而导致P1’位点只能容纳小侧链的氨基酸,并且对Gly具有最高识别效率。在我们对P2’位点的分析中发现,相对原始底物的Pro氨基酸,人鼻病毒3C蛋白酶能更有效对Met氨基酸进行切割,特别是在30℃条件下。当分别在4℃、16℃、22℃、30℃体外反应1小时后,人鼻病毒3C蛋白酶对原始底物LEVLFQ↓GP的切割效率随温度升高,从83.2%降低至47.1%,而对底物序列LEVLFQ↓GM的切割效率降低很少,仅从85.9%降低至81.5%。利用圆二色谱仪对人鼻病毒3C蛋白酶在6℃和30℃的结构进行进一步分析发现,温度的升高会导致人鼻病毒3C蛋白酶中的random coil转化为β-turn。这一结构柔和性的降低可能是导致人鼻病毒3C蛋白酶对原始底物LEVLFQ↓GP切割效率降低的原因。此外,我们也将人鼻病毒3C蛋白酶同其他典型病毒3C蛋白酶进行了底物活性口袋结构和底物特异性对比,包括口蹄疫病毒3C蛋白酶、烟草花叶病毒蛋白酶。我们初步推断,S1活性口袋的中性和酸性氨基酸决定了P1位点对Gln和Glu的高特异性,而狭小的S1’活性口袋空间是人鼻病毒3C蛋白酶区别于其他典型3C蛋白酶的主要特征。综上所述,我们的研究开发了一种简单、易行的在细胞内解析蛋白酶底物特异性的方法,并利用此方法解析了人鼻病毒3C蛋白酶的底物特异性和进一步探究了其催化机理。我们的研究为人鼻病毒3C蛋白酶的进一步研究、应用和分子改造提供了基础。