论文部分内容阅读
脂肪酶(EC3.1.1.3)即三酰甘油酰基水解酶,是一种酯键水解酶,可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸。目前已发现多种具有不同酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶,其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中已表现出良好的应用前景。脂肪酶具有来源广泛,分离纯化简单和成本低廉等诸多优点,将其作为非专一性水解酶应用于几丁质的水解,将极大的降低酶法制备几丁寡糖的成本。本文通过富集培养、初筛培养和复筛培养从土壤中获得6个具有明显脂肪酶活性的菌株,对酶活最高的一株进行26s rDNA ITS区扩增并测序,通过与NCBI中保存的数据进行相似性分析来进行菌种鉴定,同时构建菌株的进化树。经鉴定此菌株属于Rhizopus属中的Stolonifer种,中文名称为匍枝根霉。为获得最高的脂肪酶产量,在摇瓶培养条件下,利用响应面法,对匍枝根霉发酵的培养基配方和培养条件进行优化。优化后,可溶性淀粉7.60g/L,酵母膏22.59g/L, K2HPO45.55g/L, NH4Cl1.80g/L, MgSO4·7H2O2.40g/L, NaCl1.00g/L,橄榄油25.00mL/L,吐温-808.00mL/L, pH4.59,此时酶活达到最高,为1.40U/mL,与发酵优化前(0.46U/mL)相比,酶活提高了204.35%。发酵液经过离心、60%硫酸铵沉淀、透析、粗酶液浓缩、正己烷萃取、DEAE-Sepharose阴离子交换后,经SDS-PAGE电泳检测纯化后脂肪酶达到电泳纯,回收率为21.5%,纯化倍数为32,分子量约为35KD,酶活为5760U/g。以PNPP为底物,酶促反应的Km和Vmax分别为0.77mmol/L和5.39μmol/L·min。将猪胰脂肪酶、假丝酵母脂肪酶、NOVO435脂肪酶、扩展青霉脂肪酶和纯化后脂肪酶同时应用于几丁质的水解,结果发现猪胰脂肪酶水解效果最明显,对其水解几丁质的条件进行研究,通过考察酶量、底物浓度、温度、pH和反应时间等因素对猪胰脂肪酶水解几丁质的影响,确定反应条件为：反应体系2mL,猪胰脂肪酶0.01g,胶体几丁质浓度5%,pH7.0,反应温度60-C。反应30h后,几丁质的水解率为6%。