【摘 要】
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鱼类的生殖发育及调控机制一直都是生命科学研究的重要课题之一,不仅有重要的理论意义,而且在指导鱼类品种改良上有重要应用。精子活力作为雄性生殖能力的重要指标,直接影响
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鱼类的生殖发育及调控机制一直都是生命科学研究的重要课题之一,不仅有重要的理论意义,而且在指导鱼类品种改良上有重要应用。精子活力作为雄性生殖能力的重要指标,直接影响着受精率的高低和后代品质,提高雄性精子活力是鱼类品种改良的重要方向。本研究分别以黄颡鱼为研究对象,鉴定并分析了与其性别相关的基因;以斑马鱼为研究对象,寻找到一个对其精子活力有调控功能的mi RNA。为了探索黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)性别分化和性腺发育的分子机制,我们在黄颡鱼性腺转录组数据中筛选到13个相关基因。表达谱分析表明,雄性相关基因中,piwi-1和amhr2在XY雄鱼和YY超雄鱼中的表达量明显高于XX雌鱼,amh在XY雄鱼中的表达量高于XX雌鱼和YY超雄鱼。雌性相关基因中,cyp19a和foxl2在XY雄鱼和YY超雄鱼中几乎不表达,但在XX雌鱼中有一定表达。从中选取amh和amhr2两个基因作进一步研究,在一龄黄颡鱼下丘脑-垂体-性腺轴和肝脏中,amh和amhr2均在雌雄性腺中的表达量最高;amh在雄鱼性腺和垂体中的表达量显著高于雌鱼,而在雌鱼肝脏中的表达量高于雄鱼;amhr2在雌、雄黄颡鱼性腺中表达差异不显著,而在雄鱼下丘脑、垂体和肝脏中的表达水平显著高于雌性。XY雄鱼腹腔注射EE2(17α-ethinylestradiol,17α-乙炔雌二醇)后,amh和amhr2的表达量呈现先上升后下调的趋势。XX雌鱼腹腔注射MT(17α-methyltestosterone,17α-甲基睾酮)后,amh的表达量在48和72 hpt时均低于正常水平,120 hpt恢复正常;amhr2的表达量在48 hpt显著下调,72和120 hpt时约为正常水平的一半。本研究鉴定了黄颡鱼性别相关基因并分析了其表达模式,为进一步研究黄颡鱼性别决定和分化机制提供了借鉴意义。精子活力受到体内和体外多重因素的影响,精子发生中每一个过程都会影响到最终精子的活力,miR-34家族在很多研究中都被报道与性腺发育和精子发生相关。为了探究miR-34a对斑马鱼精子活力的作用,我们使用改造的CRISPR/Cas9系统构建了miR-34a-/-(miR-34a纯合突变体)斑马鱼,经过精子活力测量和比对分析,发现miR-34a-/-斑马鱼精子活力高于WT(wild type,野生型)斑马鱼,激活精子的VAP(average path velocity,平均路径速度)、VSL(straight line velocity,直线运动速度)、VCL(curvilinear velocity,曲线运动速度)等参数显著性高于WT斑马鱼(P<0.05),前进性运动精子的VAP、VSL、VCL等参数极显著性高于WT斑马鱼(P<0.01)。通过文献检索,我们知道哺乳动物中Gsk3a、Wt1等任一基因的突变或缺失都会对精子发生或精子活力造成某种伤害,上述发现都直接或间接证明了上述基因对精子活力的上调作用,而我们通过生物信息学方法发现,斑马鱼中上述基因或其等位基因的3’UTR区均存在与miR-34a种子区域(5’-...GGCAGU...-3’)互补配对的序列,这说明miR-34a可能靶向调控上述基因,从而影响斑马鱼精子活力。检测mi R-34a-/-斑马鱼肝脏、精巢、脑中上述miR-34a预测靶基因的表达量,发现每个基因的表达量都在一个或多个组织显著性升高。本研究证实了miR-34a对斑马鱼精子活力和上述预测靶基因具有负调控作用,miR-34a与其预测靶基因是斑马鱼精子活力基因调控网络的重要组成部分。
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