N-乙酰神经氨酸(NeuAc)是一种常见的唾液酸,在自然界中广泛存在,可以用于合成其他唾液酸或者唾液酸的衍生物。同其他唾液酸一样,NeuAc主要存在于糖链的末端,对细胞的生物识别具有重要作用。此外,NeuAc本身还可以作为保健食品和药品,具有较高的商业价值。目前,NeuAc的生产和提取获得方式存在诸多问题,因此使用葡萄糖等廉价碳源,在不添加任何前体的情况下来生产NeuAc具有许多优势。目前已有的微生物发酵生产NeuAc方法产量较低,不适合大规模的应用。同时,在发酵过程中有大量的乙酰葡萄糖胺和乙酰甘露糖胺积累。根据代谢特征分析,我们推测NeuAc生产的限速酶为乙酰葡萄糖胺-2-异构酶和N-乙酰神经氨酸合酶。因此选择了目前报道的酶活最高的两种乙酰葡萄糖胺-2-异构酶和三种神经氨酸合酶进行组合和摇瓶发酵。使用Agea和NeuBc替换PB后的质粒NeuAc产量提高了 1.5倍,证明了 Age和NeuB确实是NeuAc生产途径的关键酶。除了酶的来源以外,酶的表达强度对产量也有较大影响。因此在更换关键酶的基础上,我们对酶的表达强度进行了优化,使得NeuAc产量提高了 1.2倍。而继续增强表达强度没有使NeuAc产量进一步增加,证明NeuAc生产的限制改变,推测可能已经转移到另一前体PEP供给。然后我们对菌株的PEP代谢途径进行了改造,选择了六个关键基因进分别行了敲除,使得NeuAc产量进一步提高。敲除pykA的菌株减少了丙酮酸去往PEP的代谢通量,获得NeuAc产量最高。随后在敲除pykA的基础上,进行组合敲除。其中同时敲除pykA和ptsG使得NeuAc达到最高产量。为了进一步提高葡萄糖转运,我们引入了运动发酵单胞菌的葡萄糖促进蛋白glfzm基因,使得NeuAc在前期迅速积累,是引入glfzm基因之前的1.4倍。但是glfzm基因的引入导致大量丙酮酸的积累,抑制了菌株的正常代谢。这有可能是因为我们对菌株代谢的改造过于刚性而引起的代谢严重不均衡。核糖开关作为一种灵活的调节元件,已广泛应用于代谢工程中。但是核糖开关的阈值较低限制产物产量的体高。前期研究中,我们构建了 NeuAc核糖开关,并用于N-乙酰神经氨酸菌种的进化改造。但由于其阈值较低限制了其进一步应用。因此,在本研究中我们设计和建立了一种体内核糖开关进化改造的方法。TetA是一种双功能蛋白,其既可以向胞内转运Ni2+,也可以向胞外转运四环素。利用该蛋白在阳性筛选时,可以去除不响应的核糖开关,这种方法实际上已经被广泛用于筛选核糖开关。而最重要的是如何限制核糖开关的阈值,目前还没有一个有效的方法。我们设计了阴性筛选的方法,即阈值达到要求的核糖开关可以被筛选出来,而没达到要求的开关则会被淘汰掉。我们将NeuAc核糖开关连接在TetA蛋白的基因5’端,使得TetA蛋白的表达量响应于NeuAc浓度。通过添加不同浓度的Ni2+和四环素,确定了最佳的筛选浓度。并且我们进一步在摇瓶上验证了筛选条件。为了验证筛选效果,我们建立了模型文库。通过将含有核糖开关和两个不含核糖开关的阴性对照混合,使用我们确定的筛选条件进行筛选,结果在两种比例下含有核糖开关的菌株均富集到百分之九十以上。这样我们就首次建立了一个可以有效的体内进化核糖开关阈值的方法。接下来我们利用建立的核糖开关体内进化方法对NeuAc核糖开关进行进化改造。我们推测改突变结合环可以改变核糖开关结构,因此设计了在核糖开关的两个底物结合环上进行了随机突变。筛选后获得了高阈值,高灵敏度和大动态范围的核糖开关。对原始核糖开关和突变体进行结构模拟,发现了原始核糖开关和突变体在结构上发生了微小的变化。我们进行分子动力学模拟计算出了核糖开关突变体对于NeuAc的自由能,结果证明了核糖开关的突变不会使开关的配体结合能力降低,而核糖开关阈值的提高是由于能够形成有效切割构象的核糖开关比例下降引起的。流式细胞仪分析证明,突变后的核糖开关仍以同一模式进行响应,而不会影响核糖开关在代谢工程方面的应用。我们能够通过获得的核糖开关进行NeuAc途径的表达优化,增加了 NeuAc的产量,证明了途径表达增强有利于NeuAc产量的提高。而进一步对关键酶Agea突变进化,使得NeuAc产量进一步提高。经过分析我们提出,Agea的突变降低了蛋白对于ManNAc的结合能力,使反应朝向ManNAc合成方向进行。综上所述,本论文通过理性改造提高了 NeuAc产量。经过设计和验证,首次建立了核糖开关体内进化的方法,该方法具有操作简单、试验周期短、筛选效率高等优点。在生产传感器阈值改造领域,该方法属于首创,也为进化其他生物传感器提供了思路,在提高生物传感器应用范围具有重要意义。