人次级淋巴组织趋化因子(SLC)的克隆、表达和功能鉴定

来源 :第三军医大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:superficalness
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次级淋巴组织趋化因子(Secondary Lymphoid-Tissue Chemokine ,SLC),即CCL21,是趋化因子(Chemokine)超家族成员。SLC通过其受体CCR7诱导T淋巴细胞和DC(dendritic cell)进入次级淋巴组织,并由DC提呈抗原,激活T淋巴细胞。因此SLC是引发特异性免疫反应的关键趋化因子之一。研究表明,缺乏鼠SLC的小鼠其T细胞归巢和DC定位障碍,T细胞活化延迟,次级淋巴组织结构紊乱。而SLC的过表达则密切参与了多种自身免疫性疾病的发生和发展。因此,SLC及其受体有望成为治疗移植排斥反应、自身免疫性疾病和肿瘤药物设计的新靶点。为此我们克隆了人SLC成熟蛋白基因,构建了该基因的原核表达质粒,进行了重组蛋白的诱导表达、纯化及生物学活性的鉴定,旨在为进一步研究SLC在移植排斥反应、肿瘤发展与转移和自身免疫性疾病中的作用机制及应用奠定基础。该项研究取得的主要结果如下:1.通过从人扁桃体中提取总RNA,RT-PCR成功获得编码人SLC成熟蛋白的DNA片段(SLC起始密码子下游第70-405base),并将该片段插入原核表达质粒pET32a(+),成功构建了重组原核表达质粒pET32a(+)/SLC(+3),通过突变去掉目的基因与肠激酶位点间的三个氨基酸,经测序,与GenBank上登录的人SLC成熟蛋白cDNA序列(登录号AB002409)完全一致,获得SLC天然蛋白的重组原核表达质粒pET32a(+)/SLC。2.将该质粒转化大肠杆菌BL21trxB(DE3),经IPTG诱导,获得了高水平表达的融合蛋白(TrxA-SLC),并确定融合蛋白在BL21trxB(DE3)中高效表达的最佳诱导条件为终浓度1mmol/L的IPTG在37℃诱导表达3小时。SDS-PAGE分析可见,表达蛋白的大小约为30kDa,占菌体总蛋白的50%以上,可溶性蛋白约占50%。用羊抗人SLC多克隆抗体进行Western blot分析显示,在30 kDa 处出现单一阳性条带,而对照的pET32a(+)/BL21trxB(DE3)诱导菌则无此反应。3.将大量表达的融合蛋白经TALON金属亲和树脂纯化、除盐、肠激酶消化、弱阳离子交换层析,得到电泳纯的SLC重组蛋白。4.生物学活性分析显示,所制备的重组SLC可在体外趋化外周血表达CCR7的淋巴细胞,可引起外周血表达CCR7的淋巴细胞胞内钙流明显升高。功能性重组人SLC的制备,为进一步研究SLC的作用机制及研制其受体CCR7<WP=8>的拮抗剂创造了条件,同时也为相关疾病的治疗性研究奠定了物质基础。
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