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miRNA是一类长约22个核苷酸(nt)的小分子非编码RNA,它能使nRNA降解或蛋白翻译抑制而起调控基因的作用,目前在生命活动的各个过程中都有相关niRNA的报道。奶牛乳腺泌乳是一个重要的生理过程,但是关于miRNA对其调控的研究却不多。本研究采用Solexa高通量测序技术获得奶牛乳腺泌乳期和非泌乳的niRNA序列,用基因芯片和real-time PCR方法分析泌乳期和非泌乳期miRNA的表达差异。采用生物信息学技术预测这些miRNA可能的靶基因,构建以泌乳为中心的miRNA调控网络图。最后研究了miR-484通过己糖激酶对糖代谢过程的调控。主要研究结果如下：1、奶牛乳腺组织中niRNA的高通量测序为了获得奶牛乳腺组织中的miRNA,分别构建奶牛泌乳期与非泌乳期乳腺组织(?)RNA文库,用Solexa高通量测序技术分别测序,共获得15,089,573条与18,079,366条原始读数,过滤低质量、重复等序列后有11,964,909条与15,968,116条纯净序列用于后续分析。分析其长度分布,发现有超过一半的纯净序列在22nt,证明测序可靠。2、奶牛乳腺组织miRNA的鉴定和特征分析本部分主要是对获得的测序序列进行整理、归类和分析,挖掘miRNA的特征。对得到的纯净序列进行比对分类,共发现有885条pre-miRNA编码921条成熟体niRNA,在这些成熟体中有884条是唯一序列。这些唯一序列中有283条已知miRNA,96条与其他物种同源的miRNA,还有505条新发现的miRNA是。同时还分析了885条pre-miRNA在牛基因组上的定位,共有800条pre-miRNA能与牛基因组比对上,其中230条pre-miRNA能组成55个基因簇。3、泌乳期和非泌乳期奶牛乳腺中miRNA表达差异谱分析及功能预测本部分主要研究泌乳期和非泌乳期奶牛乳腺组织中miRNA表达差异,并对已知(?) miRNA进行靶基因预测,最终构建调控网络。用基因芯片和real-time PCR方法对测序序列进行分析,发现在泌乳期和非泌乳期乳腺组织中有69条rniRNA表达差异显著(P<0.01,信号值>500)。并对已知的283条miRNA进行靶基因预测,共靶向超过10,000个目标基因,平均每个miRNA有35个靶基因。GO分析发现,这些靶基因与转录因子活性相关性最高。再根据靶基因预测结果,构建了以泌乳为中心的miRNA和泌乳相关基因的调控网络图,该网络中包含了37个本实验检测到的miRNA以及15个泌乳相关基因。4、miRNA对泌乳相关基因的初步研究本部分选取HK2和STAT5以及与这两个基因相关的六个miRNA (miR-125b, miR-141, miR-181, miR-199a, miR-484和miR-500)作为研究对象,初步研究miRNA对泌乳相关基因的影响。以奶牛乳腺上皮细胞Mac-T细胞为模型,分别转染：miR-141inhibitor、miR-141mimics、miR-181mimics、miR-125b mimics、 miR-199a mimics、miR-484mimics以及miR-500mimics。用real-time PCR检坝(?)HK2和STAT5基因的表达,用western blotting的方法检测这两种蛋白的表达。结果发现与对照组相比高浓度miR-141能显著降低STAT5蛋白的表达(P<0.05),拮抗miR-141作用后STAT5蛋白表达量上升(P<0.05),但是在基因水平无明显变化。在检测HK2蛋白表达时发现只有转染niR-484mimics和(?)miR-500mimics时HK2的蛋白表达明显被抑制(P<0.05),而其余三组没有蛋白表达与对照组比无差异(P>0.05)。5、miR-484对奶牛乳腺糖代谢及关键酶的作用研究主要研究了niR-484对乳腺糖代谢的作用。由于缺乏牛HK23’UTR序列,本研究首先成功克隆获得HK23’UTR序列,构建带有预测靶位点片段的双荧光素酶报告基因载体,并与miR-484共转染进Mac-T细胞。结果证明miR-484能与HK23’UTR结合。同时用RNA干扰试验发现超表达：miR-484能显著降低已糖激酶的活性和细胞的葡萄糖吸收程度。综上所述,本研究从泌乳期和非泌乳期奶牛乳腺组织中获得884条miRNA序列；完成了对这些序列的分类、定位等特征性分析；通过分析这些miRNA在两个时期中的表达,得到69条表达差异显著的niRNA;对其进行功能预测,构建了以泌乳为中心的miRNA和泌乳相关基因的调控网络。同时,验证了miR-484(?)匕靶向作用于牛HK23’UTR序列,发现其通过抑制己糖激酶的活力,下调细胞对葡萄糖摄取能力。这些研究结果为解析泌乳过程中的信号转导机制及科学调控奶牛泌乳性能奠定了基础。