目的:沉香为著名理气止痛珍稀名贵中药,为白木香树干经外界刺激后所形成含树脂部分(俗称结香),长期以来白木香结香存在时间长、产量低、品质差等关键问题,正品沉香市场上长期供不应求,现有的人工刺激结香方法仍不能解决白木香结香的关键问题,同时耗时、耗工。生物诱导法为本团队所研发的一种白木香结香新技术,预试验显示可在短期内达到诱导白木香心材部位通体结香的效果。为进一步完善生物诱导法诱导白木香通体结香新技术,作者开展了系统研究。方法:在五华沉香基地随机选择四年生沉香18株,进行田间试验,分为生物诱导法、火烫法及空白组三组,每组6棵,分别进行刺激试验,观察并记录。刺激6个月后采样、干燥,待用。其他蚁蛀法、断干法、打洞法、霉菌法组沉香样品随机于茂名电白沉香基地采集,供药材质量评价用。分析不同刺激结香方法所得沉香产量,采用《中华人民共和国药典》(2010年版一部)中沉香项下的各项质量评价指标方法分析不同刺激结香方法所得不同沉香性状、显微、显色及浸出物含量测定鉴别特点,并采用GC-MS法、磷钨酸钼-硫酸锂比色法、HPLC法分析比较其挥发油成分组成特征,总色酮含量及色酮指纹图谱研究。同时,还采用上述方法分析了生物诱导法刺激6个月后所得沉香不同部位性状、显微、显色、浸出物含量以及挥发油成分组成特征,总色酮含量、3种色酮成分含量测定、挥发油及色酮类指纹图谱等研究。采用实时荧光定量PCR法检测HMGR、FPS等7个基因在白木香受到生物诱导法及火烫法刺激6个月内每月的基因表达变化情况,并与每月的沉香相关化学成分含量进行对比分析。对白木香诱导前后的差异蛋白质组学进行了研究,提取生物诱导及火烫诱导前后的白木香总蛋白,运用双向电泳仪对诱导前后总蛋白进行分离,考马斯亮蓝染色,通过Progenesis Same SPots软件处理,寻找到蛋白差异点,运用MALDI-TOF-MS对差异蛋白进行分析、鉴定,并对蛋白质进行功能分析。采用蛋白双向电泳方法分析白木香在生物诱导法与火烫法刺激前后蛋白差异点情况,并进行功能分析,探讨两种方法刺激结香的分子机制。结果:1不同刺激结香方法所得沉香质量评价研究1.1不同刺激结香方法所得沉香初产量与常规鉴别研究田间刺激结香试验结果表明生物诱导组对树体产生较为强烈的刺激而大量落叶、断枝,并重新长叶。生物诱导法组可整段结香,而火烫组仅为受伤洞口附近产香。不同刺激结香方法所得沉香质量差异较大。刺激半年的初产量方面,生物诱导法株产沉香327g,其他刺激结香组产量为10.74～58.41g,且生物诱导法组沉香为树干中间部分整段结香,刺激点附近可形成厚3cm、宽7.5cm、长80cm的主结香带,树干整体结香纵向全长(基部至最高结香处)可达120cm。生物诱导法及火烫法相比其他刺激结香方法获得沉香品质相对较佳。生物诱导法诱导半年所获沉香从性状、显微、显色反应及醇浸出物含量测定方面,均达到药典要求,其醇浸出物含量符合药典规定(≥10%),醇浸出物含量达11.62%,而传统火烫法诱导半年所获沉香含量仅为4.44%,其他方法所获沉香含量均低于4%。生物诱导组及火烫组沉香药材薄层行为均与对照药材相似,且生物诱导组样品薄层行为更接近于对照药材。1.2不同刺激结香方法所得沉香总色酮含量测定沉香对照药材含总色酮含量最高,为19.35±1.06 mg· g-1而白木香白木含总色酮含量最低,仅为为2.33±1.25mg·g-1不同刺激方法总色酮含量差异较大,生物诱导法组样品含量较高,为16.67± 1.35 mg·g 1;火烫法组样品次之,其总色酮含量为8.34±0.64mg · g-1其他组样品色酮含量在3.12±0.83～6.45±1.47mg · g-1范围内。1.3不同刺激结香方法所得沉香GC-MS研究不同刺激结香方法中生物诱导法组及火烫法组样品与对照药材所含沉香特征性成分较多,检出物总相对含量均高于50%。其他刺激结香组所含沉香特征性成分较少,蚁蛀组、断干组、打洞组检出物个数较少,其总相对含量依次为39.92%、37.13%、49.85%。霉菌法检出数量及相对含量均较低,基本同白木。传统人工结香方法中火烫法所含沉香特征成分较多,接近于对照药材;但生物诱导法所结沉香含有倍半萜成分相对含量、个数及芳香族成分相对含量、个数等均更接近对照药材,其总体检出物相对含量及个数与对照药材更相近。1.4不同刺激结香方法所得沉香色酮类成分HPLC指纹图谱研究建立了沉香药材HPLC指纹图谱共用模式,通过对照品指认了 10个共有峰中1个共有峰。相似度评价显示,不同刺激方法所得沉香药材在化学成分的组成上存在较大差异。对照药材与生物诱导法组、火烫法组三组药材中化学成分相似度较高。聚类分析结果显示生物诱导法组与对照药材聚为一类。2生物诱导法诱导结香不同部位的研究2.1生物诱导法刺激结香不同部位的鉴别研究根据实际结香颜色变化情况,将该法刺激6个月所得沉香分为外侧黑色部分(B1部位～B4部位)及内侧棕色部分(Z1部位～Z4部位)。B1部位-B4部位沉香各指标基本相同,Z1部位～Z4部位基本相同,但B部分与Z部分差异较大。醇溶性浸出物含量测定结果显示,B1～B4均达到《中华人民共和国药典》(2010年版一部)沉香项下要求,超过10%,而Z1～Z4均未达标。B1～B4各样品薄层行为一致,且与对照药材基本相同,而Z1～Z4各样品薄层行为一致,但与对照药材相比,仅有3个斑点Rf值一致。2.2生物诱导法刺激结香不同部位总色酮含量测定B1-B4样品总色酮含量较高,为13.78±0.38～16.69±0.35mg·g-1,其中B4部分色酮含量相比B1～B3部分低,为13.78±0.38mg·g-1;而Z1～Z4中色酮含量为1.42±0.05～4.19土0.12mg·g-1 且 Z4 含量最低。2.3生物诱导法刺激结香不同部位GC-MS成分分析B部分倍半萜及色酮两类成分种类丰富,相对含量较高,但B1～B3样品成分较接近,B4部位样品除含沉香特征性倍半萜及色酮类特征成分外,还含有其他芳香族化合物等非沉香特征性成分。Z部分所含多为脂肪酸、直链烷烃类成分,未检测到色酮类成分及其他特征性倍半萜,与B部分差异较大。2.4生物诱导法刺激结香不同部位GC-MS指纹图谱研究生物诱导法刺激所得沉香B部分及Z部分样品相似度皆较高,达到0.8638～0.9605%,0.8596～0.9163。2.5生物诱导法刺激结香不同部位3种色酮成分含量测定不同部位不同色酮含量差异较大。B1～B4样品Aquilarone B、Aquilarone C含量分布规律为B1最高,含量为3.2282及0.9889mg · g-1其次B2、B4,其含量分别为 2.0369 及 0.6527 mg· g-1、1.8024 及 0.3439 mg· g-1 含量最低的为 B3,达到 1.4847及0.3152mg·1-1;CX16为B4最高,含量为7285mg·g-1,其次B3、B1,含量为0.4519及 0.3633 mg·-1,最低的为B2,含量为0.24mg·-1。3生物诱导法结香机制研究3.1生物诱导法刺激结香基因表达研究生物诱导法组中白木香DXS1、HMGR及FPS基因基本为下调表达,且下调幅度较小;而火烫法组白木香此三个基因则明显上调表达,且均在刺激后5个月内明显上调表达,变化幅度较大,其中FPS基因表达上调近100倍,HMGR为30多倍。生物诱导法诱导后ASS1与TPS基因基本可上调表达,ASS1在3个月后表达到最高,随后4至6个月后表达下调;TPS在5个月后开始上调表达,6个月后表达到最高,生物诱导法组该2个基因表达变化幅度不大,跟DXS1、HMGR及FPS相似。而火烫组ASS1及TPS在5个月后突然表达量急剧增大,上调至1000多倍。TPS基因在白木香受到生物诱导法组诱导后,上调幅度比ASS1小,其表达量在5至6个月后达到最大,但总体变化幅度不大。在火烫组中TPS表达情况同ASS1,在刺激5个月后明显上调表达。生物诱导法组白木香受诱导后CHS1表达量水平基本呈下调趋势,总体变化幅度不大,而火烫组CHS1在5个月后其表达上调近600倍。CHI1基因受到生物诱导法诱导后表达量水平变化不大,在3个月后表达达到最高,随后开始下调,而火烫法组白木香CHI1基因在刺激后开始下调,但5个月后表达突然增大至10倍,随后开始下调。3.2生物诱导法诱导结香化学成分及其与基因表达对比研究生物诱导法组沉香乙醚浸出物、倍半萜及色酮类成分的相对含量在前3个月无明显变化,4个月后开始各含量开始增加,随后继续增长,至6月份已经可检测生物诱导法组沉香乙醚浸出物含量为5.13%,倍半萜及色酮类成分相对含量为22.04%及64.41%。同样,火烫法组沉香刺激后前3个月未检出色酮成分,倍半萜成分仅为0.35%,随后4个月后各含量指标开始上升,6个月后可检测火烫法组样品乙醚浸出物含量为1.05%,倍半萜及色酮类相对含量为10.55%及42.02%。同基因表达量对比分析,生物诱导法组除TPS表达量与乙醚浸出物含量、倍半萜及色酮类成分的相对含量趋势为上升外,其他均无较明显的规律。火烫组沉香在基因水平及化学水平所呈趋势较为明显,总体均呈上升趋势,基本一致。3.3生物诱导法刺激所得沉香蛋白双向电泳研究通过对生物诱导法及火烫法刺激所得沉香进行蛋白提取、双向电泳及质谱测定等步骤,在每张蛋白双向电泳凝胶图谱上检测到1500～1900个有效蛋白点,其中三组(生物诱导法组、火烫法组及空白组)两两对比共有903个差异斑点,鉴定成功32个,并进行功能分析,鉴定出的蛋白质功能主要集中在呼吸作用、能量代谢、逆境胁迫、次生代谢、氨基酸合成等方面。结论:1不同刺激方法所获沉香质量差异显著,生物诱导法组所获沉香各项指标均达到药典标准,其质量及产量显著优于其他方法所获沉香。生物诱导法诱导半年所获沉香性状、显微、显色反应及醇浸出物含量均符合药典标准,其薄层行为、总色酮含量、挥发油成分、色酮指纹图谱均最接近于对照药材,聚类分析显示为唯一与对照药材聚为一类者;而其他刺激方法所获沉香醇浸出物含量均远远达不到药典限量标准,其薄层行为、总色酮含量、挥发油成分、色酮指纹图谱、聚类分析等均与对照药材有显著差异。此外,生物诱导法结香产量显著高于其他方法。显然,生物诱导法组所获沉香质量显著优于其他方法者,已达到药典规定的沉香药材标准,且产量显著高于现有方法。2生物诱导法组不同部位沉香质量差异显著,Z部分应为从白木到沉香的过度阶段。通过对生物诱导法所得沉香不同部位进行一般鉴别,发现B部分一般鉴别方法测定后品质较佳,基本同对照药材,但不同部位各指标有所不同,可能由于生物诱导法对于白木香树树干上下不同部位的诱导机制略有不同,或者受到树体蒸腾或输导作用的不同而产生细微差异。Z部分均不符合要求,可能由于采集样品时间仅为6个月,但已为生物诱导法的优化提供依据。通过对生物诱导法所得沉香不同部位B1～4及Z1～4等样品进行总色酮含量测定结果分析,总色酮含量H及Z部分从1～4样本基本依次递减。经GC-MS指纹图谱分析,生物诱导刺激所得沉香B部分及Z部分样品进行相似度评价,根据结果可推测生物诱导法所产沉香上下不同部位(1～4部分)成分差异不大,反映了结香技术成熟可靠。根据HPLC法测定不同部位3种色酮含量结果,发现总体分布规律为B部分中B1或B2色酮含量较高,Z部分中Z1色酮含量最高,其他部位不同色酮含量无明细规律。Z部分仍能检测到3种色酮,其中Z1中Aquilarone B及Aquilarone C含量接近B部分样品含量。对不同部位沉香样品进行HPLC指纹图谱分析,并进行聚类分析,根据聚类分析结果可推测生物诱导法所产沉香上下不同部位(1～4部分)成分差异不大。其中Z部分样品与自然结香沉香聚为一类,可见Z部分在化学成分方面在一定程度上仍有沉香的特点。3不同刺激方法6个月内相关基因表达量差异显著,与有效成分具有一定相关性,蛋白差异点分布不同,提示生物诱导法与传统火烫法结香机制有所不同。通过对不同刺激结香方法诱导后白木香6个月内不同时间点,各有效成分生物合成途径关键酶基因表达量进行测定,结果发现生物诱导法对于各个基因总体表达情况影响不明显,主要集中在刺激3个月或5个月后;而火烫组各个基因表达情况特征明显,主要为5个月后突然明显增大表达,部分基因表达量甚至达到近1000倍。可见,两种方法对于形成沉香特征性成分的生物合成途径关键合成酶基因的影响不同,推测两种方法可能启动了不同的萜类或黄酮类生物合成途径,或者由于沉香形成是一种庞大复杂,且结合多种生物合成途径的一系列生理生化反应而形成,本实验仅取6个月内白木香心材,对于结香机制可提供一定依据,但科学系统及全面的结香机制研究仍需对多个目标基因多时间点地进行跟踪监测。分析各基因表达量与化学成分动态变化规律发现,生物诱导法组除TPS表达量与乙醚浸出物含量、倍半萜及色酮类成分的相对含量趋势为上升外,其他均无较明显的规律。火烫组沉香在基因水平及化学水平所呈趋势较为明显,且基本一致。通过双向蛋白电泳对生物诱导法及火烫法白木香进行差异蛋白分析,结果发现两差异斑点数量有一定差距,提示可能两种刺激结香方法在结香机理方面有所不同,与相关合成酶基因表达情况有一定的联系。而生物诱导法相比火烫法虽在差异蛋白数量上具有较大差距,但仍能启动白木香一系列防御反应机制,且所形成的沉香在化学成分方面品质高于火烫法,可能生物诱导法所启动的白木香防御机制在本实验的采样时间范围内无明显作用或者启动机制与一般刺激结香方法不同,有待进一步深入研究。白木香受到火烫刺激后很可能启动了目前所公认的萜类及黄酮类生物合成途径,且启动机制较为持久,调控较复杂,在5个月后各基因仍能明显上调表达,对于揭示沉香形成机制提供有力依据。对于鉴定出的蛋白质进行功能分析,发现部分蛋白质与白木香受到伤害胁迫有关。