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目的:采用Lable-free(非标记定量蛋白组学)技术,从唾液蛋白组的动态变化中证实肾-唾相关的科学内涵;探索肾虚体质、肾虚证候的的特异性差异蛋白及其形成过程中的生物标志物,探索六味地黄丸的药物分子靶标,为多种慢性病、老年病的防治提供客观依据。方法:(1)基于“恐伤肾”理论,采用“猫吓鼠”的实验动物造模方法,复制“先天不足+后天失养”的肾虚质动物模型。将16只孕鼠随机分为Ⅰ、Ⅱ组,Ⅰ组6只孕鼠孕期不恐吓,正常喂养,待其产子后随机抽取12只仔鼠,作为正常体质组,雌雄比例1:1。Ⅱ组的10只孕鼠,妊娠次日起予以恐吓,产子后随机抽取48只仔鼠,作为肾虚体质组、肾虚证候组、肾虚体质干预组、肾虚证候干预组,每组12只,雌雄比例均为1:1。将各组仔鼠正常喂养四周后,肾虚证候组、肾虚证候干预组采用氢化可的松肌注造模十天。从第十一天,运用六味地黄丸对肾虚体质干预组、肾虚证候干预组治疗一个月。(2)造模成功后,收集各组大鼠唾液,运用Lable-free技术进行质谱信号的检测,差异蛋白的筛选,采用层次聚类分析,GO注释富集分析,KEGGpathway分析以及网络相关性分析法对差异蛋白进行定性定量分析。结果:(1)大鼠一般状况观察:正常体质组大鼠饮食如常、毛色润泽、行为敏捷、二便正常、体重增长快;肾虚体质组大鼠出现躁动易惊、毛发稀疏、体重减轻、活动量减少、尿量减少等现象;肾虚证候组大鼠、毛发枯糙色黄、反应迟钝、大便干、饮水量增加、尿量减少、尾巴色红、弯腰弓背、易扎堆。肾虚体质组大鼠用药后体质量有所增长、毛色改善、毛发量增加、活动量尚可。肾虚证候组大鼠用药后毛色有光泽、饮水量尚可、大便成形但不干燥,弯腰弓背的状况有所改善。(2)Lable-free唾液蛋白组学质谱检测:各对比组共检测到肽段2655个,蛋白1302个。以unique peptide>0,Foldchange>1.2或<0.83,且P-value<0.1,蛋白有确定的基因名称为差异蛋白的筛选标准。与正常体质组(简称ZC)对比,肾虚体质组(简称ST)大鼠有差异蛋白14个,其中上调蛋白5个,下调蛋白9个;与肾虚体质组对比,肾虚体质干预组(简称STG)有差异蛋白18个,其中上调蛋白16个,下调蛋白2个;Gm2a,Lghv7-4,Nucb2为这两个对比组共有的蛋白。Gm2a,Lghv7-4在ST-VS-ZC组中下调,在STG-VS-ST组中上调。而Nucb2在ST-VS-ZC组中上调,在STG-VS-ST组中下调,差异具有统计学意义(p<0.05)。与正常体质组比较,肾虚证候组(简称SZ)有差异蛋白8个,其中上调蛋白3个,下调蛋白5个;与肾虚证候组比较,肾虚证候干预组(简称SZG)有差异蛋白6个,其中上调蛋白5个,下调蛋白1个。Cst5为这两个对比组共有的差异蛋白,在SZ-VS-ZC组中下调,在SZG-VS-SZ组中上调。Prr4,Grpcb,Bpifa2为ST-VS-ZC组和SZ-VS-ZC组中共有的蛋白,前两者均为下调蛋白,Bpifa2为上调蛋白。Tcn2为STG-VS-ST组和SZG-VS-SZ组共有的蛋白,均为上调蛋白。结论:(1)本次实验复制的“先天不足+后天失养”的肾虚体质动物模型,氢化可的松肌注的肾虚证候动物模型,符合各自的动物模型特征。(2)对差异蛋白进行筛选和定性定量分析,发现Gm2a,Lghv7-4,Nucb2可能为肾虚体质的特异性蛋白,为六味地黄丸的干预靶点。Cst5可能为肾虚证候的特异性蛋白及六味地黄丸的干预靶点。(3)Prr4,Grpcb,Bpifa2可能为肾虚体质和肾虚证候共有的特异性差异蛋白。Tcn2可能为六味地黄丸干预肾虚的靶点。(4)溶酶体、氮代谢、细胞凋亡可能为肾虚质的特异性途径,溶酶体、细胞凋亡可能为六味地黄丸的干预途径。唾液分泌、肾素血管紧张素系统可能为肾虚证候的特异性途径,唾液分泌可能为六味地黄丸的生物标志物。