研究背景细胞衰老指的是细胞发生不可逆性的细胞周期停滞现象，能被多种应激如DNA损伤、端粒缩短、氧化应激等所激发，衰老能缩减细胞的寿命及抑制其增殖能力，所以诱导细胞衰老是肿瘤治疗的一个重要手段。临床上，许多抗癌药物及电离辐射（Ionizing radiation，IR）正是通过诱导肿瘤细胞衰老这一重要机制而发挥抑制肿瘤细胞生长作用。本课题组前期研究也证实IR诱导的肺癌细胞杀伤很大程度上归因于诱导细胞衰老而不是细胞凋亡。这表明诱导衰老在抗肿瘤化疗和放疗中发挥了举足轻重的作用。白藜芦醇（Resveratrol，RV）是红酒、葡萄等植物中的天然成分。研究表明RV具有抗氧化、抗病毒、抗炎抗菌、免疫护肝、抗血小板凝集、治疗心血管病等作用，同时它也是一个潜在的防癌和抗癌剂。但其抗癌、防癌的分子机制目前仍不十分清楚。尽管有研究显示高剂量(100～200μM)能通过诱导凋亡来抑制肿瘤细胞的增殖，但这种诱导细胞凋亡的高浓度在体内环境是难以达到的。临床上，大部分肿瘤患者被采用放射治疗，然而，放射耐受性是放射治疗成功的主要障碍，往往导致肿瘤的复发以及治疗失败。因此，当前迫切需要发现新的放射增敏剂，用于克服耐放射，进而提高放射治疗的疗效。近年来的研究显示RV能提高肿瘤细胞对化疗及放疗的敏感性以及诱导肿瘤细胞死亡。然而，RV对放射增敏的机制仍有待于研究。至于RV是否以及如何影响IR诱导的肺癌细胞的衰老目前几乎未见明确报道。因此，本研究的主要目的是探讨低剂量RV是否能抑制肺癌细胞的生长及其影响机制，以及RV是否能促进IR诱导的衰老，提高肺癌细胞对放射的敏感性。第一部分白藜芦醇对肺癌细胞衰老的影响及机制1.白藜芦醇对肺癌细胞生长的影响为探讨RV对肿瘤细胞生长的影响，本研究分别用不同剂量的RV （5～100μM）处理非小细胞肺癌细胞系A549和H460细胞，然后用MTS法和克隆形成实验检测RV对非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）细胞的生长的变化。MTS实验结果表明，与对照组相比，剂量为5μM的RV对A549和H460细胞均无明显抑制效果（P＞0.05），剂量从10到100μM的RV均能显著抑制肺癌细胞的生长，且剂量越高，抑制率越高，各组间的差异均具有显著性意义（P＜0.001）。其中100μM的RV的抑制率高于98%，细胞绝大部分已经死亡。克隆形成实验的结果表明，即使剂量低至10μM的RV可以明显抑制A549和H460细胞的克隆形成活性，且剂量越高，抑制率越高，各组间的差别均具有显著性意义（P＜0.001）。结果表明，10～100μM RV能抑制NSCLC细胞的生长，且呈剂量依赖性。2.白藜芦醇抑制肺癌细胞生长与凋亡的相关性流式细胞术分析发现低剂量（10～50μM）RV能将NSCLC细胞阻滞于G0/G1期，但并不能引起细胞的凋亡，而100μM RV引起细胞一定量的凋亡，与50μM RV组差异有统计学意义。活性casepase-3和PARP是检测凋亡的最经典的指标，细胞经不同剂量的RV处理后，用Western blotting检测RV对A549及H460细胞中活性casepase-3和活性PARP的表达变化。结果显示，10～50μM RV处理后的A549细胞及H460细胞中活化caspase-3及PARP的表达均未出现表达；而与此相比，用100μM RV处理后的A549细胞及阳性对照物顺铂处理后的A549细胞与H460细胞中均有明显的活化caspase-3及PARP的表达。结果提示，低剂量（10～50μM）RV并非通过诱导细胞凋亡来抑制A549及H460细胞的生长，而100μM RV可诱导细胞凋亡。3.低剂量白藜芦醇抑制肺癌细胞生长与衰老的相关性用SA-β-gal染色、BrdU核素掺入法以及Western Blotting检测白藜芦醇对A549及H460细胞衰老的影响。结果显示：经RV处理后，细胞形态发生明显改变，随着RV剂量增加，细胞数量越来越少，且形态越来越扁平，细胞体积及核的体积越来越大；SA-β-gal染色结果显示：无论是对A549细胞还是H460细胞，低剂量RV能使SA-β-gal阳性细胞数量增多，细胞的SA-β-gal阳性率随RV的剂量增加而提高，10μM组与对照组相比P＜0.05，其余各组与对照组相比均为P＜0.001。BrdU结果显示：经RV处理后细胞中BrdU的阳性率明显降低，且随着RV剂量增加，肺癌细胞与BrdU结合率逐渐降低。表明RV能明显抑制DNA合成，抑制细胞增殖，且呈剂量依赖性，各组之间有显著性差异（P＜0.001）。Western Blotting结果表明，经RV处理后P53及P21的表达明显上调，且剂量越高，蛋白表达水平越高；而经RV处理后细胞内EF1A的表达明显下调。提示RV诱导A549细胞及H460细胞衰老与P53、P21及EF1A的表达高度相关。结果提示：低剂量（10～50μM）RV能通过诱导细胞衰老抑制NSCLC细胞生长。4.低剂量白藜芦醇对肺癌细胞DNA损伤及ROS生成的影响γ-H2AX是细胞DNA损伤的重要标记物，本研究用γ-H2AX免疫荧光实验及中性彗星实验（Neutral Comet Assay）检测RV对NSCLC细胞DNA的影响。结果显示：RV能引起A549细胞及H460细胞中γ-H2AX焦点明显增多，彗星实验结果发现，经RV处理后，细胞核明显形成细长的彗星尾，且剂量越高，彗尾越长；经过CASP软件分析发现彗星尾矩及Olive尾矩均随RV剂量加大而延长。结果表明低剂量RV的抑癌作用至少部分是由于RV诱导NSCLC细胞DNA损伤的结果。活性氧（reactive oxygen species, ROS）在DNA损伤中发挥重要作用。因此，本研究推测，RV可能通过促进NSCLC细胞ROS生成导致DNA双链断裂。为了验证这一假设，本实验采用DCF-DA染色结合流式细胞仪检测法，探讨低剂量RV对NSCLC细胞ROS生成的影响。结果显示：经10、20、50μM RV处理A549及H460细胞后，细胞内ROS生成量均有不同程度的增加，其中10μM RV处理A549及H460细胞后，与对照组差别均无统计学意义（P＞0.05），而20μMRV组及50μM RV组与对照组差别均有显著意义（P＜0.01）。结果提示：低剂量（10～50μM）通过促进ROS生成引起细胞DNA损伤。5. NAC对低剂量白藜芦醇诱导的DNA损伤及衰老的影响虽然以上结果表明，RV诱导的DNA双链断裂与NSCLC细胞ROS产生增加有关，但用抗氧化剂抑制ROS的产生是否能削弱RV诱导肿瘤细胞DNA损伤和衰老，尚需进一步的实验研究。为此，本研究用NAC预处理细胞30min后，用RV处理A549或H460细胞，用SA-β-gal染色和γ-H2AX免疫荧光实验检测NAC对RV诱导的DNA损伤及衰老的影响。结果显示：RV诱导的衰老细胞（SA-β-gal阳性细胞）所占百分比明显减少，细胞中γ-H2AX焦点也明显减少。表明NAC能够削弱RV诱导的NSCLC细胞DNA损伤和衰老。上述结果强有力地支持低剂量RV通过ROS介导的DNA损伤诱导肺癌细胞衰老这一推测。6.低剂量白藜芦醇促进肺癌细胞产生ROS的机制探讨为进一步探讨RV诱导肿瘤细胞ROS产生的机制，本研究用Real-time PCR检测NADPH氧化酶NOX家族以及对调节细胞内ROS有重要作用的抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和硫氧还蛋白（thioredoxin，TXN）在RV处理前后A549及H460细胞中的表达变化。结果显示：对于Nox家族，RV主要选择性增加A549和H460细胞中Nox5的表达，其余各基因的表达变化均不明显；而对于抗氧化酶，RV仅会导致A549细胞中SOD2表达微量增加（小于2倍），H460细胞中SOD1，SOD2和TXN mRNAs均无明显变化。结果提示：RV主要是通过上调Nox5基因达表达促进NSCLC细胞产生ROS。小结（1）低剂量（10～50μM）白藜芦醇通过非凋亡机制抑制A549及H460细胞的生长；（2）低剂量（10～50μM）白藜芦醇通过ROS介导的DNA损伤诱导A549及H460细胞衰老。第二部分白藜芦醇对肺癌细胞放射敏感性的影响及机制1.低剂量白藜芦醇对电离辐射诱导肺癌细胞毒效应的影响第一部分的研究结果表明，RV可诱导NSCLC细胞衰老。为检测低剂量RV是否可提高NSCLC细胞对IR的敏感性，本研究用20μM RV（以DMSO作为对照）预孵育A549和H460细胞4h后，再用不同照射剂量的IR处理细胞。克隆形成实验用于观察RV对IR诱导NSCLC细胞毒效应的影响。结果显示：RV处理后的A549和H460细胞的克隆形成率明显下降。提示：RV是一个潜在的放射增敏剂，可提高肺癌细胞对IR的敏感性。为进一步探讨RV提高肺癌细胞对放射敏感性的机制，用Western Blotting检测RV对照射的肺癌细胞中活化casepase-3及PARP的表达变化。结果表明，经RV预处理后，照射的肺癌细胞中活化casepase-3及PARP的表达无明显改变。而阳性对照药顺铂能导致活化casepase-3及PARP的表达的显著增加。这些结果表明：RV通过非凋亡的机制提高肺癌细胞对放射的敏感性。2.低剂量白藜芦醇对电离辐射诱导肺癌细胞衰老的影响本研究组前期实验显示：IR以剂量依赖的方式诱导肺癌细胞衰老，这表明衰老在肿瘤抑制中起着重要的作用。为探讨RV是否可通过促进IR诱导肺癌细胞的衰老提高肺癌细胞的放射敏感性，本研究采用SA-β-gal染色法检测RV对照射的A549和H460细胞的衰老情况。结果显示：RV和IR联合处理能使NSCLC细胞中SA-β-gal阳性率比单独用RV或IR处理明显提高。Western Blotting结果显示，经RV和IR联合处理后P53及P21的表达比用RV或IR单独处理明显上调。提示：RV通过促进IR诱导的衰老提高肺癌细胞对放射的敏感性。3.低剂量白藜芦醇对电离辐射诱导的肺癌细胞DNA损伤的影响DNA损伤是化疗和IR诱导衰老的主要原因，为研究RV是否通过促进IR对NSCLC细胞的DNA损伤而诱导细胞衰老，本研究采用γ-H2AX免疫荧光实验及中性彗星实验检测RV处理前后照射的NSCLC细胞中DNA的损伤情况。γ-H2AX检测结果发现RV及IR均可导致NSCLC细胞中γ-H2AX焦点增多，而RV与IR联合处理后，NSCLC细胞中γ-H2AX焦点进一步增多，与RV或IR单独处理时差异有显著性。中性彗星实验结果显示：RV和IR联合处理后，NSCLC细胞彗星尾明显延长，彗尾DNA的含量明显增加，提示联合处理比IR或RV单独处理会出现更多的DNA双链断裂。结果表明：RV可通过促进IR诱导的DNA双链断裂促进肺癌细胞衰老。4.低剂量白藜芦醇对照射的肺癌细胞AKT及mTOR磷酸化的影响研究表明，抑制Akt活性能提高肿瘤细胞对IR的敏感性。为研究RV能否抑制NSCLC细胞Akt和mTOR活化，本研究用Western blotting检测RV与IR联合处理前后H460细胞中p-Akt和p-mTOR的表达水平。结果显示：RV与IR联合处理后，H460细胞p-Akt和p-mTOR的表达水平明显低于RV或IR单独处理组。RV与IR联合处理也可导致mTOR下游靶底物pS6K的磷酸化显著下降；结果还显示，与单独使用RV或IR相比，RV和IR联合处理能导致NSCLC细胞中p-p53和p-Chk2水平显著增加。由于p53和Chk2磷酸化是DNA损伤的重要的生物标志物，实验结果进一步证实了RV能促进IR诱导的NSCLC细胞DNA损伤。5.低剂量白藜芦醇对照射的肺癌细胞产生ROS的影响ROS是诱导细胞DNA损伤和介导细胞衰老的重要因素。为研究ROS是否参与介导RV的放射增敏作用，本研究采用DCF-DA染色结合流式细胞术分析RV与IR联合处理前后的肺癌细胞中ROS表达水平变化。结果表明：与单独使用RV或IR相比，RV与IR联合处理可显著增加NSCLC细胞内ROS的产生。结果提示：ROS可能在RV诱导的放射增敏中发挥关键作用。6. NAC对低剂量白藜芦醇介导的肺癌细胞的放射增敏效应的影响为进一步探讨ROS在RV介导的放射增敏的作用，本研究分析了抗氧化剂NAC对RV增强IR诱导NSCLC细胞DNA损伤和衰老的影响。彗星实验结果显示，用NAC预孵育后能使细胞彗尾明显缩短，彗尾DNA含量明显减少。提示：NAC能削弱RV对IR诱导的DNA双链断裂的作用。SA-β-gal染色结果显示，用NAC预处理后，细胞的SA-β-gal阳性率明显降低。提示：减少ROS生成能明显削弱RV对IR诱导肺癌细胞衰老的增强作用。结果表明：RV能通过ROS介导的肺癌细胞DNA损伤促进IR诱导细胞衰老。小结：1）低剂量（10～50μM）RV通过非凋亡机制提高肺癌细胞对放射的敏感性；2）低剂量（10～50μM）RV通过ROS介导的肺癌细胞DNA损伤作用促进IR诱导的细胞衰老。结论：1.低剂量（10～50μM）白藜芦醇通过ROS介导的DNA损伤诱导肺癌细胞衰老。2.低剂量（10～50μM）白藜芦醇通过促进IR诱导的细胞衰老提高肺癌细胞对放射的敏感性。