肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率高居肿瘤死亡之首,近年来其发病率及死亡率均呈明显上升趋势。2002年世界肺癌新发病例1,350,000人,死亡1,180,000人,肺癌占新发恶性肿瘤发病总数的12.4%。在我国的大中城市中,肺癌的死亡率更高居恶性肿瘤首位。2005年我国约有540,000人患肺癌,其中约480,000人死亡。肺癌中腺癌的发病率上升迅速,在美国、加拿大及北欧等国家肺腺癌已超过肺癌总数的一半,在亚裔肺癌患者中,肺腺癌也正将超过鳞癌成为最常见的肺癌类型。尽管手术、放化疗等肺癌传统治疗手段不断发展,但由于70%的肺癌患者在确诊时都属中晚期,往往失去根治性手术机会,而作为肺癌非手术治疗主要手段的化疗,虽然不断改进方案,但是毒副作用大,化疗耐药性等难题仍制约其临床应用及疗效,总体临床疗效令人失望,肺癌的生存期并未得到提高。在美国,其5年生存期不到15%；在发展中国家更低于9%。寻找有效的、毒副作用小的抗癌药物是肺癌治疗的关键。中草药以其毒副作用较小、药效可靠等优势,成为抗癌新药筛选比较理想的天然产物资源。但由于中药成分复杂、作用机制不明确,大大限制了其在肿瘤治疗方面的开发和利用。高通量筛选是目前药物发现的主流方法,筛选库是其重要的组成部分。与目前常见的组合化合物药物库和药物衍生物药物库相比,天然化合物药库具有数量庞大、结构多样等巨大优势。中药作为筛选样品库更具有应用历史悠久、药效确切等巨大优势。但是,由于化合物分离工作量大,耗时长,目前并没有规模足够大的筛选样品库。因此建立适合高通量筛选的中药样品库,从中发现新的抗癌活性化合物是目前肿瘤药物筛选的新思路。本研究利用制备型HPLC对500种常见中草药按亲水性排列,连续收集小分子组分建立中药样品组分库。每种草药收集80个组分,建立了含40000个中草药组分的天然小分子样品库。在此样品库基础上,通过细胞增殖抑制测定,针对人肺腺癌A549细胞系进行高通量筛选。以改良MTT法检测细胞活性,在酶标仪540nm波长下测定吸光度A540,计算细胞生长抑制率,抑制率大于50%的药物作为阳性结果。选取脾细胞毒性较小的组分经分析型液相色谱分离纯化后得到活性化合物,结合质谱及核磁技术鉴定化合物结构,确定抗癌活性的单体化合物。在此基础上,进一步检测活性化合物对A549细胞及人外周血白细胞的50%增殖抑制率(IC50)。通过Hoechst33258染色观察活性化合物处理后的细胞形态学变化；通过流式细胞仪分析活性化合物对细胞周期的影响。本研究结果表明,从500种常见中药成功得到40,000个组分,每个组分所含有的主要成分(可见峰)<20,从而构建成中药高通量筛选组分库。以肺腺癌A549细胞系为药物筛选的细胞模型,在建库的200种中药的16000个组分进行了高通量筛选,其中8种中药共24个组分能够显著抑制肺腺癌细胞A549增殖。这些中药是：远志、益智仁、补骨脂、草薢、藕节、浮小麦、急性子、卷柏。小鼠脾细胞毒性试验发现,急性子及卷柏活性组分处理24小时后的小鼠死亡脾细胞比对照组略有增加,总死亡细胞数目较少,提示其毒副作用较小,因此选择急性子及卷柏进行进一步活性化合物分离。利用分析型HPLC确定了急性子的活性组分E3对应的保留时间13.75分钟,并纯化得到对应的化合物。经过质谱和核磁共振技术分析,急性子的活性单体化合物为槲皮素。槲皮素对A549肺腺癌细胞24小时的50%增殖抑制率(IC50)为10.8μmol/l。这些结果证明了本天然产物高通量筛选体系的可行性及有效性。同样方法,利用分析型HPLC确定了卷柏活性组分G8对应的保留时间为25.80分钟,纯化得到对应的活性化合物,经过质谱和核磁共振技术分析后发现,此化合物为首次从卷柏中分离得到的新的活性单体化合物ALA(考虑今后的新药开发及专利申请,故暂称ALA),其对A549肺癌细胞24小时的IC50为10.2μmol/l。在此基础上,本研究选择首次从卷柏中发现的活性化合物ALA进行进一步药理实验。MTT检测ALA对人的外周血总白细胞毒性的IC50为62.5μmol/l,表明ALA对外周血白细胞毒性作用较小。Hoechst33258染色荧光显微镜下可见ALA处理24小时后的A549细胞内出现明显的高亮蓝色的典型凋亡小体,细胞核呈现染色质凝集,细胞皱缩,细胞核固缩、碎裂、体积变小,荧光强度增高的细胞凋亡特点。通过流式细胞仪分析表明ALA处理的A549细胞周期受到调控,G2/M期细胞相对增多,肿瘤细胞出现凋亡。另外,对其他阳性中药组分的活性单体化合物分离和作用机制的研究工作正在进行中。综上所述,本研究1.成功建立了适用于高通量筛选的中药样品组分库；2.从中药组分库中筛选出抑制人肺腺癌A549细胞增殖的8种中药的24个组分；3.成功从中药急性子中分离得到活性单体化合物槲皮素,证明了目前的HTS系统的可行性及有效性；4.首次从中药卷柏中分离出活性单体化合物ALA；5.ALA可阻滞A549细胞于G2/M期,从而使肿瘤细胞增殖减缓；6.ALA可诱导肺腺癌A549细胞凋亡；7.ALA具有毒性小,抑癌活性强的特点,为肺腺癌的治疗提供了新的途径；8.其他6种阳性中药组分的活性单体化合物分离及机制的研究工作正在进行中。