论文部分内容阅读
海马结构是脑边缘系统中的重要结构,与学习、记忆、认知功能有关,尤其是空间学习与短期记忆。海马结构由海马、齿状回(Dentate gyrus,DG)、下托和围绕胼胝体的海马残体组成。海马是成体神经干细胞(Neural Stem Cell,NSC)的发源地之一,海马齿状回颗粒下区的NSC可通过增殖分裂产生新的子代细胞,整合到局部神经环路中,参与学习记忆过程。海马根据皮质发育和纤维排列的不同可分为:CA1、CA2、CA3和CA4区,细胞学研究表明,海马头部主要由CA1区折叠而成,而CA1区对缺氧等损伤极为敏感,也被称为易损区,因此海马头部CA1区也是最易发生病变的部位。已有文献报道CA1区和DG区之间存在纤维联系,但CA1区兴奋性变化对DG区的影响及其机制仍然不清楚。由于CA1区对DG区中最重要的神经纤维投射是谷氨酸能神经纤维投射,因此本实验拟研究:(1)通过光遗传技术观察CA1区谷氨酸能神经元兴奋状态改变对DG区NSC增殖的影响;(2)观察CA1区谷氨酸能神经元兴奋状态改变对动物学习记忆的影响;(3)通过Western blotting方法观察SDF1α/CXCR4/CXCR7信号通路中CXCR4在海马中的表达情况。通过以上研究,可能为临床上调控神经干细胞生成、增殖和分化提供实验室证据。目的利用光遗传技术和行为学方法研究海马CA1区谷氨酸能神经元对DG区神经干细胞增殖的调控作用以及对动物学习记忆的影响。方法1.实验动物:一月龄雄性C57BL∕6NCrl小鼠。2.光敏病毒转染及分组:将小鼠麻醉后,根据小鼠图谱海马CA1定位注射携带光敏基因ChR2和eNpHR的病毒载体及其对照,分别命名为ChR2组和ChR2-对照组、eNpHR组和eNpHR-对照组。3.病毒表达检测:注射病毒2周后,冰冻切片,分别在荧光显微镜下检测海马CA1区ChR2病毒和eNpHR病毒表达水平。4.Morris水迷宫隐蔽平台实验:注射病毒2周后,进行Morris水迷宫隐蔽平台实验,训练小鼠学习寻找隐藏在水中的平台,共计学习6天。5.光遗传刺激:Morris水迷宫隐蔽平台实验第7天,采用光遗传技术,分别用蓝光和绿光激活光敏通道蛋白ChR2和eNpHR,特异性地兴奋或抑制CA1区谷氨酸能神经元。6.Morris水迷宫空间探索实验:光遗传刺激后6 h、12 h、24 h、72 h后再分别进行Morris水迷宫空间探索实验,记录动物进入目标象限的次数和在目标象限所用时间的百分比,作为空间记忆能力的检测指标。7.免疫荧光检测DG区NSCs增殖:Morris水迷宫实验后,迅速进行4%多聚甲醛心脏灌注,取脑组织,连续冰冻切片,免疫荧光检测海马DG区NSC数量。8.Western blotting法检测CXC趋化性细胞因子(CXCR4)的表达:Morris水迷宫实验后,迅速分离海马组织,通过Western blotting方法观察SDF1α/CXCR4/CXCR7信号通路中CXCR4的表达情况。9.统计学分析:利用SPSS21.0进行统计分析,数据结果采用平均数±标准误(Mean±SEM)表示,用单因素方差分析或独立样本t检验。P<0.05认为有统计学差异。结果1.病毒注射2周后,分别在荧光显微镜下检测海马CA1区ChR2病毒和eNpHR病毒表达,结果显示均有相应荧光标记表达,表明光敏病毒转染成功。2.Morris水迷宫隐蔽平台实验结果显示,光刺激之前,ChR2组和eNpHR组与其对照组相比,逃避潜伏期均无明显差异(P>0.05)。3.光遗传蓝光刺激兴奋海马CA1区谷氨酸能神经元6 h、12 h、24 h、72 h后进行Morris水迷宫空间探索实验,结果表明光刺激24 h和72 h后ChR2组的穿越平台次数(5.50±1.38,6.67±2.06)较ChR2-对照组(2.67±1.03)显著增多(*P<0.05,***P<0.001);光刺激6 h、12 h、24 h和72 h后ChR2组在目标象限的百分比(31.04±7.90%,33.08±7.92%,37.47±7.89%,44.20±8.36%)较ChR2-对照组(17.89±5.91%)显著增加(*P<0.05,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。4.光遗传绿光刺激抑制海马CA1区谷氨酸能神经元6 h、12 h、24 h、72 h后进行Morris水迷宫空间探索实验,结果表明光刺激24 h和72 h后eNpHR组的穿越平台次数(1.0±0.63,0.67±0.52)较eNpHR-对照组(2.47±0.93)显著减少(**P<0.01,***P<0.001);光刺激12 h、24 h和72 h后eNpHR组在目标象限的百分比(8.60±2.82%,5.79±2.19%,4.92±2.49%)较eNpHR-对照组(18.91±5.79%)显著降低(**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001)。5.兴奋海马CA1区谷氨酸能神经元,蓝光刺激后12 h、24 h和72 h后ChR2组海马DG区Nestin阳性细胞数(56.40±16.26,70.51±19.41,111.71±18.33)比ChR2-对照组(48.09±9.87)显著增多(*P<0.05,***P<0.001,***P<0.001)。6.抑制海马CA1区谷氨酸能神经元,绿光刺激后12 h、24 h和72 h后eNpHR组海马DG区Nestin阳性细胞数(40.13±15.71,27.79±8.96,14.33±8.81)比eNpHR-对照组(47.04±9.56)显著减少(**P<0.01,***P<0.001,***P<0.001)。7.兴奋海马CA1区谷氨酸能神经元后,Western blotting结果显示,光刺激24 h和72 h后ChR2组的CXCR4表达量比ChR2-对照组显著增多(*P<0.05,*P<0.05)。8.抑制海马CA1区谷氨酸能神经元后,Western blotting结果显示,光刺激24 h和72 h后eNp HR组的CXCR4表达量比eNpHR-对照组显著减少(*P<0.05,***P<0.001)。结论1.特异性的兴奋CA1区谷氨酸能神经元后促进DG区NSCs的增殖和小鼠学习记忆能力增强。2.特异性的抑制CA1区谷氨酸能神经元后抑制DG区NSCs的增殖和小鼠学习记忆能力减弱。3.海马CA1区谷氨酸能神经元对DG区NSCs增殖的影响,可能与基质细胞衍生因子(Stromal cell derived factor,SDF1α)的受体蛋白CXCR4有关。