基于生物传感器电化学法超敏检测原癌基因选择性多聚腺苷酸化的研究

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选择性多聚腺苷酸化(Alternative polyadenylation,APA)普遍存在于真核生物中,在基因的表达调控中起着重要的作用。通过APA调控,基因可以选择不同的多聚腺苷酸化位点,产生带有不同长度3’UTR(3’-Untranslated region)的mRNA异构体。研究表明,在不同的癌细胞和癌组织中,基因特别是原癌基因更倾向于使用带有短链3’UTR的mRNA转录本,而且这种转录本与肿瘤的诊断分型和预后密切相关,因此它可以作为一种新型的肿瘤生物标志物,对它们的检测具有良好的临床价值和应用前景。尽管传统的生物学方法(qPCR、Northern blot、高通量测序等)在APA的检测中有诸多的应用,但这些方法或多或少存在的一些缺点限制了它们的应用,如:成本高、操作复杂、耗时久等。近年来,电化学检测技术引起了学界相当大的关注。与传统的生物学检测方法相比,电化学生物传感器法具有诸多突出的优越性能,如成本低、仪器设备小、实验操作简单、选择性好、灵敏度高等。但是,至今还没有用电化学方法检测基因APA的报道。为此,本研究把超分子材料、纳米粒子及生物探针有机结合起来构建生物传感器,有效地提高了检测的灵敏性及特异性,大大降低检测限度,对已在乳腺癌和肺癌中报道的Dicer1和CCND2两个原癌基因的APA实现了超敏检测,详述如下:第一部分:以磺化杯[6]芳烃(SCX6)和氧化石墨烯(GO)为原料,通过加热回流的方法合成得到了SCX6-RGO复合物,引入Au纳米材料增大传感能力,并用傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform infrared spectroscopy,FTIR)、热重分析(Thermogravimetric Analysis,TGA)、Zeta电位(Zeta potential)、原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)等方法对制备的纳米材料进行材料表征。选择亚甲基蓝(Methylene blue,MB)作为电信号物质,通过差分脉冲伏安法(Differential pulse voltammetry,DPV)进行电信号检测。选取人的乳腺癌细胞系BT474、SKBR3作为实际检测样品,通过总RNA提取和cDNA的反转,对这些cDNA样品进行Dicer1 APA的检测。结果显示,在两种乳腺癌细胞系中带短链3’UTR的Dicer1 mRNA的表达量(Dicer1-S)显著高于带长链3’UTR的转录本(Dicer1-L);检测到Dicer1-S的线性范围为:10-1410-9M,检出限为3.5 fM;Dicer1-L的线性范围为10-1510-10M,检出限为0.53 fM。检测结果也用传统的实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)进行了验证,得到了相似的结果。因此,该生物传感器彰显了良好的特异性和灵敏性,具有潜在的应用价值实用性。第二部分:以磺化杯[8]芳烃(SCX8)和氧化石墨烯(GO)为原料,通过一步法制取SCX8-RGO复合物,同时用湿热法合成了Fe3O4纳米材料,并加入Au纳米粒子(Au nanoparticals,AuNPs)分别合成Au@SCX8-RGO及Au@Fe3O4复合材料。通过IR、TEM、XPS等方法对制备的材料进行表征,确认材料构建成功后,以甲苯胺蓝(Toluidine blue,TB)为电信号物质用丝网印刷电极对目标物进行DPV检测。选取人的肺癌细胞系H292及正常的肺组织细胞Base-2B作为实际检测样品,通过提取它们的总RNA,并直接对总RNA进行CCND2 APA的检测。结果显示在两种肺癌细胞系中带短链3’UTR的CCND2转录本(CCND2-S)表达量显著高于带长链3’UTR的CCND2转录本(CCND2-L)的表达量;CCND2-S的检测线性范围为:10-1810-11M,检出限为0.176 aM;CCND2-L的检测线性范围为10-1710-11M,检出限为9.5 aM。用qPCR进行结果的验证也得到相似的结果。本研究是第一次用电化学生物传感器的方法对由APA现象所产生不同的3’UTR异构体进行表达分析的工作,提示了APA可能作为一种潜在的生物标志物用于肿瘤的诊断和预后,为癌症的临床诊断提供了一种快速、超敏、便捷的检测方法。
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