作为能量密度最高的化合物之一,三酰甘油（Triacylglycerol,TAG）是生产生物柴油的优质原料。TAG主要存在于植物种子或果实,仅在少数植物的营养器官有显著累积,如块茎富油作物-油莎豆。深入探究植物营养器官TAG生物合成的分子机制,利用基因代谢工程增加非粮作物营养器官TAG合成积累水平是应对全球能源需求的一项有效途径。在植物体内,淀粉是主要的还原碳储存库,约一半以上光合作用固定的碳源以淀粉形式短暂地储存起来。植物光合碳同化产物不仅分配用于淀粉合成,也可分配用于油脂和蛋白质等途径。有关光合碳同化产物如何有效分配于各代谢通路的调控机制还不清楚。作为淀粉合成的限速酶,腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）的活性决定着植物体内淀粉合成速度和累积量。下调AGPase的表达可减低淀粉合成,节省下来的碳同化产物可用于油脂合成等途径。二酰基甘油酰基转移酶（Diacylglycerol acyltransferase,DGAT）催化酰基-Co A和二酰基甘油（DAG）生成TAG,是植物合成TAG关键酶之一。我们前期成功克隆了块茎富油作物-油莎豆（Cyperus esculentus）Ce DGAT2-2基因,异源表达Ce DGAT2-2基因可显著促进植物营养器官富集油脂。烟草种植面积广阔,叶片等营养组织生物量大,被认为是一种优异的工业生物质作物。本文以普通烟草（Nicotiana tabacum）为基因工程受体材料,系统解析内源Nt AGPase小亚基基因（Nt SSUs）功能。通过CRISPR/Cas9技术敲除Nt SSU1基因功能,降低淀粉合成对碳同化产物的竞争。同时,过表达油莎豆Ce DGAT2-2基因,增加TAG合成,以期充分拉动可用碳源流向油脂合成途径。结合这两种基因修饰策略,在烟叶中实现相对低能淀粉向能量密集型存储油脂的转化,以期创育“烟叶富油型”烟草新种质,为生物质能的规模化生产提供高能生物种质和科学理论。主要研究结果如下:1.烟草Nt AGPase小亚基（Nt SSUs）基因的鉴定与表达分析以拟南芥（Arabidopsis thaliana）At AGPase小亚基（At APS1和At APS2）蛋白序列为索引,在烟草数据库进行Blast分析获得两条同源序列,命名为Nt SSU1和Nt SSU2。利用高保真RT-PCR从烟草叶片中克隆到Nt SSU1和Nt SSU2基因的编码序列。生物信息学分析表明,Nt SSUs编码蛋白定位于叶绿体,无跨膜结构、磷酸化位点及信号肽位点。通过RT-PCR和q RT-PCR检测Nt SSUs基因在烟草不同组织中的表达谱显示,Nt SSUs基因在烟草各组织中均有表达,但表达水平差异较大。Nt SSU1基因在叶片高表达,在根、茎和花亦有一定表达量,在种子中表达量极低。Nt SSU2基因在叶片不表达,在其他组织低表达。此外,在烟草生长发育的不同时期,Nt SSU1基因的表达水平与叶片淀粉积累模式相吻合,推测Nt SSU1和Nt SSU2分别在烟草不同组织中发挥作用,其中Nt SSU1主要在叶片中行使功能。2.过表达Nt SSU1基因显著提高烟叶组织淀粉的合成和烟草生物量为鉴定烟草Nt SSU1基因的功能,采用农杆菌介导的叶盘转化法在烟草过表达Nt SSU1基因,通过PCR和q RT-PCR筛选得到9株具有潮霉素抗性的阳性转基因烟草株系。相比于野生型烟草,转基因烟草叶片AGPase酶活性和淀粉含量均有不同程度的增加。随着淀粉含量的显著增加,烟叶中蛋白质、总脂、可溶性糖的含量也发生相应地改变。此外,转基因烟草的生长速率和生物量提高。这表明Nt SSU1基因是调控烟叶淀粉合成的主效基因,决定着烟叶中淀粉的累积水平。3.CRISPR/Cas9靶向敲除Nt SSU1基因显著减低烟叶淀粉含量构建靶向Nt SSU1基因的CRISPR/Cas9敲除载体,农杆菌介导转入烟草,通过Sanger测序筛选到ntssu1突变株系（MS）。其中,在靶位点1处发生两个碱基（T和T）片段缺失,靶位点2处发生一个碱基（A）片段缺失。在突变株叶片中,Nt AGPase酶活性显著降低,从野生型的6.81 mg/（g·min）降低到2.29 mg/（g·min）,进一步表明烟草Nt SSU1基因位于AGPase催化中心,显著影响AGPase酶活性。烟叶中淀粉含量显著降低,从野生型的14.3%降低到5.1%。此外,ntssu1突变体叶片中可溶性糖和蛋白质含量显著升高,总脂含量没有明显变化,这说明降低淀粉合成可释放多余碳源,这些碳源被机体分配到其他代谢途径,但仅调控淀粉代谢途径不能实现碳源的定向调控。4.结合Nt SSU1基因敲除和异源过表达油莎豆Ce DGAT2-2基因以重构碳通路,使光合碳同化产物更多地导向油脂合成途径,创制“烟叶富油型”烟草种质为培育“烟叶富油型”烟草种质,在ntssu1突变株中过表达油莎豆Ce DGAT2-2基因,以在野生型烟草过表达Ce DGAT2-2基因为对照。通过DNA和RNA水平检测鉴定出转基因烟草植株,分别命名为MS/OD和WT/OD。相比于ntssu1突变株,MS/OD中淀粉含量轻微降低,从5.6%降低到4.3%;总脂含量显著增加,从8.2%增加到15.7%。更为重要的是,MS/OD总脂含量比WT/OD高出4.9%。这表明在Nt SSU1基因突变的同时过表达Ce DGAT2-2基因可显著促使碳通量更多地导向油脂合成途径,促进烟叶富集更多的油脂。这种重构碳通路的效应远高于仅突变Nt SSU1基因或过表达Ce DGAT2-2基因的功效。此外,转基因烟草中脂肪酸组分和含量也发生了明显变化。与WT/OD相比,MS/OD饱和脂肪酸（C16:0、C18:0、C20:0）含量降低,不饱和脂肪酸（C18:1、C18:2、C20:1）含量增加。其中,油酸（C18:1）的含量是野生型的2.95倍。高含油酸的油脂更适合制备优质生物柴油。综上所述,本研究在烟草中鉴定到两个Nt AGPase小亚基基因（Nt SSU1和Nt SSU2）,通过烟草遗传转化论证了Nt SSU1基因参与烟叶淀粉合成及烟草生长发育调控。采用CRISPR/Cas9系统敲除烟草Nt SSU1基因的同时异源过表达油莎豆Ce DGAT2-2基因,使转基因烟草叶片的碳通量从淀粉转移到油脂合成,显著提高了储存油脂的含量。此外,转基因烟草油脂脂肪酸组分明显改善,更适合制备油脂生物柴油。本研究为深入解析植物营养组织光合碳分配及调控机制,以及培育富油型烟草提供了新见解和有效的基因工程策略。