乳腺癌是人类女性癌症中第一大威胁,对于犬来说,乳腺肿瘤也是犬类第二大高发肿瘤,在癌症治愈的重重难关中,临床常用抗癌药顺铂耐药性的发展是乳腺癌治疗失败的主要原因之一,顺铂不止是在乳腺癌中被报道有抗药性发生,也存在于宫颈癌、结肠癌、前列腺癌等等癌症中。顺铂耐药的产生使癌细胞能够逃避凋亡、增强上皮-间充质转化（EMT）能力和癌症干细胞（CSC）特性、激活Wnt/β-catenin等多条信号通路,上述一系列反应,均与被称为“癌症特征”基因之一的Sox4基因表达变化有关。Sox4的高表达预示着预后不良,Sox4可通过多种机制来促进癌症的发展,包括调控细胞的增殖、EMT、自我更新、凋亡,并可以通过Wnt、PI3K/Akt、Notch、Hedgehog等信号通路网调控细胞活动。其中,Sox4对Wnt信号非常重要,它可以直接与β-catenin相互作用以激活基因表达,但其中的机制尚不完全清楚。故本试验分别以犬乳腺肿瘤（CMGT）原发灶中分离培养的CHMp细胞系和利用CHMp细胞系构建的顺铂耐药CHMpCIS细胞系为研究对象,探究Sox4对犬乳腺肿瘤增殖及顺铂耐药的影响,以及Sox4在Wnt/β-catenin通路中的作用和两者之间的互作关系。本试验首先对从CMGT原发病灶中分离出的细胞系CHMpparent进行极限稀释纯化,得到单克隆细胞株CHMp,再根据浓度梯度法,用递增浓度的顺铂对其进行持续刺激,构建顺铂耐药细胞系CHMpCIS。其次,通过对CHMpCIS和CHMp细胞进行IC50检测、耐药指数计算、形态学观察、增殖能力检测、细胞凋亡检测、凋亡与耐药相关蛋白检测、Transwell迁移与侵袭实验、EMT与CSC相关蛋白检测、微乳球形成实验、平板克隆实验,评估CMGT顺铂耐药细胞系构建是否成功,以及观察CHMpCIS细胞的表型、生物学特性变化。再次,通过激活或抑制Wnt/β-catenin信号通路,对CHMpCIS和CHMp细胞进行上述检测和Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白检测,评估CHMpCIS细胞的Wnt/β-catenin信号通路激活水平变化。然后,通过检测乳腺癌患犬的乳腺癌组织及其癌旁组织、CHMpCIS和CHMp细胞的Sox4表达差异,评估Sox4在犬体内外对乳腺肿瘤发生发展和顺铂耐药的影响。通过敲除CHMpCIS细胞的Sox4基因并检测敲除效果,选择敲除效果最明显的细胞系命名为siSox4-2,敲除无关基因的细胞系命名为siNC,用这两株细胞系进行后续实验。通过对siNC和siSox4-2细胞进行增殖能力检测、Transwell迁移与侵袭实验、微乳球形成实验、平板克隆实验,凋亡与耐药、EMT与CSC、Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白检测,评估Sox4对CHMpCIS细胞的顺铂敏感性、增殖与凋亡、EMT与CSC特性、Wnt/β-catenin信号通路活化状态的影响。最后,激活Wnt/β-catenin信号通路,检测Sox4表达水平,评估Wnt/β-catenin信号通路激活对Sox4表达水平的影响。试验结果如下:（1）本研究历时16个月成功构建CMGT顺铂耐药细胞系,命名为CHMpCIS,其耐药指数RI=5.001＞3。功能验证结果显示CHMpCIS细胞形态改变、增殖变缓、抗凋亡能力增强、EMT和CSC特性增强、Wnt/β-catenin通路激活,与CHMp组相比差异显著（p＜0.01）。（2）CMGT组织的Sox4表达水平较癌旁组织高,CHMpCIS细胞的Sox4表达水平较CHMp细胞高,统计学差异显著（p＜0.01）。（3）沉默Sox4基因所得的siSox4-2细胞,其顺铂抗性、EMT特性、CSC特性、Wnt/β-catenin通路激活水平,较沉默无关基因所得的siNC细胞弱,统计学差异显著（p＜0.01）。（4）siSox4-2细胞的Wnt/β-catenin通路激活水平下降,激活siSox4-2细胞的Wnt/β-catenin信号通路会上调其Sox4的表达水平,统计学差异显著（p＜0.01）。综上所述,实验首次探究了Sox4在CMGT细胞产生顺铂抗性过程中发挥的作用,Sox4可与Wnt/β-catenin信号通路形成正反馈回路,并通过调控Wnt/β-catenin信号通路发挥促癌作用,参与顺铂敏感性的调节。对临床组织的检测也证实,Sox4在CMGT组织中高表达。这些发现可能为CMGT的临床治疗提供新的靶点和治疗策略,并为人类乳腺肿瘤（HMGT）的研究提供参考。