1研究背景和目的随着科技进步,人类寿命的延长,全世界已步入老龄化时代。老年人口的身心健康成为当前普遍关注的社会问题。在泌尿外科的男科学范畴,男性更年期综合征是热点研究的方向之一。尽管学术界对男性更年期综合征还有着诊断和治疗上的争议,但是雄性激素部分缺乏是男性更年期综合征的重要原因之一已是无可争辩的事实。随着年龄增长,包括生殖器官在内的全身器官系统都逐渐发生老年性退变,在男性则表现为睾丸逐渐萎缩,睾丸间质细胞发生凋亡,合成分泌雄激素的功能随之衰减。目前,对男性更年期综合征最主要的临床治疗手段是用化学合成的雄性激素进行补充治疗。由于人体长期应用化学合成的雄激素可引起多种不良反应,用药安全性成为限制普及使用雄激素补充治疗的瓶颈。因此探讨开发生物源性雄激素补充治疗、促进睾丸间质细胞再生等方面,为研究全新治疗方法开拓了新思路。睾丸间质细胞成群分布在曲细精管的疏松结缔组织中。从青春期开始,睾丸间质细胞受垂体前叶嗜碱性细胞分泌的间质细胞刺激素(黄体生成素)的作用,能合成分泌雄性激素(睾酮)。睾酮被运输到身体各处的靶器官,通过与雄激素受体结合发挥重要的生理作用,如促进精子的发生和男性生殖器官发育,以及维持第二性征和性功能。碱性成纤维细胞生长因j’(bFGF)广泛存在于脑、垂体、肝、肾、骨、软骨、角质细胞、血管平滑肌细胞、成肌细胞、星形细胞等组织中,能促进来源于中胚层及神经外胚层的细胞增殖、分化并调节细胞功能。有研究表明,该因子可促进血管生成、创伤愈合、组织修复与再生以及胚胎的发育与分化。胰岛素样生长因子1(IGF1)主要由人肝细胞合成和分泌,对胚胎分化、个体发育、糖及脂肪代谢起着重要调节作用。男性生殖系统来源于中胚层,bFGF和IGF1对睾丸间质细胞的分化、增殖及其再生的调节作用等方面的研究却鲜见报道。本论文所叙述的研究是利用对成年睾丸间质细胞特异性抑制剂——乙烷二甲烷硫砜(EDS)使大鼠的成年睾丸间质细胞凋亡,构建活体动物模型及体外培养的曲细精管模型,并利用该模型系统地研究bFGF和IGF1对成年大鼠LC的再生、分化、增殖作用,以阐明其分子机制,为开展对睾丸间质干细胞进行诱导分化进而促使睾丸间质细胞再生的方法治疗男性更年期综合征提供理论依据和实验基础。根据研究目的,把实验分成以下3个部分：(1)构建大鼠ALC敲除(knock-out)模型。分别从活体大鼠和体外培养的两个方面构建(2)研究和IGF1对活体大鼠睾丸间质细胞再生及睾酮分泌的影响。bFGF(3)研究和IGF1对体外培养的大鼠曲细精管中睾丸间质细胞再生及bFGF睾酮分泌的影响。2研究方法2.1构建曲细精管活体大鼠AL敲除(knock-out)模型将3月龄SD雄性大鼠共35只,随机分成3个组：11只为空白对照组、11只为溶剂对照组、11只为EDS处理组。空白对照组不做任何处理,溶剂对照组给予腹腔注射配制EDS溶液的溶剂与超纯水的混合液),EDS组按75(DMSO的剂量予腹腔注射mg/kg处理后的第1、2、3、4、5、6、7天每组EDS。EDS处死1只大鼠,在上述各时间点抽取大鼠的血液,用放射免疫(RIA)法测定大鼠血清中睾酮含量。EDS处理后的14、21、35、56d,各组分别处死1只大鼠。提取各个时间点的大鼠睾丸标本制作大鼠睾丸病理切片进行HE染色和3β-HSD以及11p-HSDl免疫组化染色进行形态学观察并计算染色细胞数。2.2构建体外培养的大鼠曲细精管ALC敲除模型按75mg/kg的剂量予3月龄SD雄性大鼠腹腔注EDS,7d后用CO2窒息法处死。然后在无菌条件下取出睾丸,经D-PBS漂洗,用剪刀去睾丸被膜,将其置于含冷冻PBS的培养皿中。用无齿镊子分离开曲细精管,去除周围附着的所有血管组织和杂细胞,并用PBS及DMEM/F12培养基漂洗数次,然后放入34℃培养箱中进行培养。根据培养基的不同,将样品分为ITS组和ITS+LH组,加入试剂培养28d后，每隔3.5d更换1次培养基,取1次上清液,用放射免疫(RIA)法测量上清液的睾酮含量。2.3bFGF和IGF1对活体大鼠睾丸间质细胞再生及睾酮分泌的影响将3月龄雄性SD大鼠140只进行完全随机分组：空白对照组20只、溶剂对照组20只、EDS处理组100只；EDS处理组又分为bFGF组20只、FGFR抑制剂(PD166866)组20只、IGF1组20只、IGFR抑制剂(PPP)组20只、生理盐水组20只。空白对照组不做任何处理,溶剂对照组给予注射配制EDS的溶剂(DMSO与超纯水的混合液),EDS组的大鼠按75mg/kg的剂量腹腔注射EDS溶液1次。在EDS单次腹腔注射后从第7天开始,进行不同细胞因子的处理。其中bFGF组是按照100μg·kg-1·d-1的剂量做bFGF腹腔注射,每日1次,共7d；PD166866组按照100μg·kg-1·d-1的剂量做PD166866腹腔注射,每日1次,共7d；IGF1组是按照100μg·kg-1·d-1的剂量做IGF1腹腔注射,每日1次,共7d；PPP组按照100μg·kg-1·d-1的剂量做PPP腹腔注射,每日1次,共7d；生理盐水组是按照0.6mL·kg-1·d-1的剂量腹腔注射生理盐水,每日1次,共7d。根据睾丸间质细胞增殖分化代表的不同时间点,在EDS注射后第14、21、35、56天麻醉分别处死每组大鼠,取出肝脏、肾脏、双侧睾丸并测量质量；抽取各个时间点的血液用放射免疫(RIA)法测定大鼠血清中卵泡刺激素(FSH)、睾酮(T)含量；提取各个时间点的大鼠睾丸标本,分别做：(1)制作病理切片,并进行HE染色、进行LHR免疫组化SABC染色；(2)提取睾丸组织总蛋白,用Western Blot法检测睾酮合成关键限速酶类固醇合成急性调节蛋白(StAR)的表达量。2.4bFGF和IGFI对体外培养的大鼠曲细精管中睾丸间质细胞再生及睾酮分泌的影响先做好EDS处理后大鼠曲细精管体外培养模型,分成ITS组(对照组)、LH组、bFGF组和IGF1组。对照组不做因子处理,其余按组别加入LH和200、100、10ng/mL3种不同质量浓度的bFGF和IGF1进行处理,然后进行以下实验：(1)SLC增殖实验：24h后用EdU荧光标记后观察细胞增殖的图像并计算细胞数量,以检测bFGF和IGF1对SLC的促增殖作用；(2)SLC分化实验：用同样的因子处理方式培养72h,至14d和21d时从样品中收集上清液,用放射性免疫方法测定培养上清中睾酮含量；从曲细精管样品中提取RNA,用Q-PCR方法测定LC雄激素合成通路各个关键酶RNA表达情况；从曲细精管样品中提取蛋白质,用Western-Blot方法测定LC雄激素合成通路各个关键酶蛋白的表达情况；同时对曲细精管样品做3p-HSD染色并观察染色阳性的细胞数。根据实验结果从上述几个方面评估bFGF和IGF1对大鼠SLC的诱导分化功能。2.5统计学分析本实验数据使用SPSS17.0版进行统计学分析,计算各组平均值x和标准差s,数据表示为x±s。验证EDS对活体大鼠ALC影响时,使用随机区组设计的Two-way ANOVA分析；验证离体培养曲细精管模型时使用重复测量的方差分析,先进行Mauchly球形检验,若P>0.05,满足球形假设,无需校正；若P<0.05,则不满足球形假设,需用ε校正系数来校正自由度,本实验采用Greenhouse-Geisser校正的结果。多组单因素均数间比较采用One-way ANOVA分析,先检验方差齐性,若P≥-0.05,选择基于方差齐同的方差分析结果,若P<0.05,选择基于方差不齐的方差分析结果。方差齐同者选择Bonferronl法比较,方差不齐者采用Tamhane’s T2法比较。P<0.05时认为差异具有统计学意义。3结果及分析3.1大鼠ALC敲除模型的构建对比空白对照组和EDS处理后1-4d以及14、21、35、56d的大鼠睾丸切片HE染色剂及3β-HSD、11β-HSD1染色和免疫组化技术发现：EDS处理后第1天,睾丸间质细胞大量减少,持续大约7-14d,此后睾丸间质细胞数目逐渐增多。第21天可在睾丸间质中检测到3β-HSD以及11β-HSD1被染色的细胞。检测EDS处理1-7d的大鼠血清睾酮含量,与空白对照组比较,发现睾酮含量急剧下降。对该数据进行随机区组设计的双因素方差分析,结果发现：1-7d时间段影响睾酮下降的主要因素是分组因素,即对大鼠进行了EDS处理(F=79.902,P=0.000),而溶解EDS的溶剂的影响因素可以忽略不计,时间因素则没有统计学意义(F=0.795,P=0.591)。分离已被敲除ALC大鼠的曲细精管,经过ITS和ITS+LH培养28d后,在培养基的上清液中均可检测出睾酮,在两种培养基中,睾酮的含量呈现先增加后减少的峰值模式,LH处理组检测出睾酮含量较ITS高。把两种培养方式28-49d测得的上清液睾酮含量,用重复测量的方差分析,结果说明时间效应有统计学意义(F=13229.399,P=0.000)；分组效应有统计学意义(F=1815.516,P=0.000)；时间与处理方式交互效应也有统计学意义(F=4677.716,P=0.000),说明在ITS组与ITS+LH组,睾酮含量随时间变化而发生改变,睾酮含量变化也与处理因素有关,即培养基中使用LH可增加睾酮含量。3.2bFGF和IGF1对活体大鼠睾丸间质细胞再生及睾酮分泌的影响(1)不同处理组在4个时间点对大鼠重要器官及血清FSH、T含量的影响如下：EDS单次腹腔注射后,大鼠各组间肝脏质量差异有显著性的是14d(F=13.822,P=0.000)、21d (F=9.427,P=0.000)、35d (F=3.907, P=0.006)和56d (F=65.112,P=0.000)。EDS单次腹腔注射后大鼠各组间双侧肾脏质量差异没有显著性的是14d(F=13.822,P=0.000)、21d(F=0.801,P=0.577)和35d (F=2.191,P=0.074);有显著差异的是56d(F=26.927,P=0.000)。EDS单次腹腔注射后大鼠各组间双侧睾丸质量差异有显著性的是14d(F=31.864,P=0.000)、21d (F=14.640, P=0.000)、35d (F=22.190,P=0.000)和56d(F=13.965,P=0.000)。EDS单次腹腔注射后大鼠各组间血清FSH含量在各时间点差异均无显著性的是4d(F=1.207,P=0.332);21d(F=1.471, P=0.224);35d(F=2.259, P=0.067);56d (F=2.260,P=0.066)。EDS单次腹腔注射后大鼠各组间血清睾酮含量差异有显著性的是14d(F=4.731,P=0.002)、21d (F=4.131,P=0.004),35d(F=28.781, P=0.000)和56d (F=26.678,P=0.000)。(2)对上述各指标差异有显著性的时间点再做进一步组间比较结果发现。溶剂组的大鼠肝脏、双肾、双侧睾丸、血清FSH和T含量与空白对照组比较,差异没有统计学意义(P>0.05)。EDS处理后14d,生理盐水组的肝脏质量、双侧睾丸质量均低于空白对照组组,差异具有统计学意义(P<0.05)；bFGF组的双侧睾丸质量高于生理盐水组,差异具有统计学意义(P<0.05)。EDS处理后21d,生理盐水组的肝脏质量低于空白对照组,IGF1组的肝脏质量高于其受体抑制剂PPP组,差异具有统计学意义(P<0.05)。生理盐水组的双侧睾丸质量低于空白对照组,bFGF组的双侧睾丸质量高于生理盐水组和其抑制剂PD166866组,差异具有统计学意义(P<0.05)。EDS处理后35d,生理盐水组的双侧睾丸质量低于空白对照组,bFGF组的双侧睾丸质量高于生理盐水组和其抑制剂PD166866组,差异具有统计学意义(P<0.05)。bFGF组的血清T含量高于生理盐水组、其抑制剂PD166866组和IGF1组,差异具有统计学意义(P<0.05)。EDS处理后56d,生理盐水组的肝脏质量低于空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)；生理盐水组的双侧肾脏质量低于空白对照组,IGF1组的双侧肾脏质量高于生理盐水组、bFGF组和其受体抑制剂PPP组,差异具有统计学意义(P<0.05); bFGF组的双侧睾丸质量与生理盐水组的差异没有统计学意义(P>0.05),但高于其受体抑制剂PD166866组,IGF1组的双侧睾丸质量高于其受体抑制剂PPP组,差异具有统计学意义(P<0.05); bFGF组和IGF1组的血清T含量都高于生理盐水组,bFGF组的血清T含量高于其受体抑制剂PD166866组,IGF1组的血清T含量高于其受体抑制剂PPP组,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)不同处理组在各时间点对睾丸间质细胞的形态学影响。通过石蜡切片HE染色观察,EDS注射从14d开始,睾丸间质细胞出现再生和增多,直至56d时出现成熟的睾丸间质细胞。通过对睾丸切片的LHR染色发现,睾丸间质中LHR染色阳性的细胞数有同样的再生和增多的情形。bFGF组和IGF1组对睾丸间质细胞增多的效应高于生意盐水组,也高于它们各自的受体抑制剂组。(4)不同处理组在各时间点对大鼠睾丸StAR蛋白表达量的影响。EDS单次腹腔注射后大鼠各组间睾丸StAR蛋白表达量差异有显著性的是14d (F=1229.996, P=0.000)、21d (F=108.672, P=0.000)、35d (F=191.784,P=-0.000)和56d(F=9.624,P=0.000)。再做进一步组间比较,结果发现：EDS处理后14、15d, bFGF组的睾丸StAR蛋白表达量高于生理盐水组、其受体抑制剂PD166866组和IGF1组,IGF1组的睾丸StAR蛋白表达量高于生理盐水组、其受体抑制剂PPP组,差异具有统计学意义(P<0.05); EDS处理后第35天,bFGF组的睾丸StAR蛋白表达量高于生理盐水组、其受体抑制剂PD166866组和IGF1组,IGF1组的睾丸StAR蛋白表达量高于其受体抑制剂PPP组,差异具有统计学意义(P<0.05); EDS处理后第56天,IGF1组的睾丸StAR蛋白表达量高于生理盐水组、其受体抑制剂PPP组,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.3bFGF和IGF1对体外培养大鼠曲细精管SLC再生、分化及睾酮分泌的影响1)SLC增殖实验。将LH以及3种不同质量浓度的bFGF、IGF1作用于体外培养的大鼠曲细精管后,检测EdU染色的细胞数量,与对照组(ITS组)比较,结果发现：不同浓度的细胞因子作用24h后,各处理组曲细精管上EdU染色的细胞数量之间差异有显著性(F=5238.932,P=0.000)。对不同处理组做组间比较后发现：所有组别曲细精管上EdU染色的细胞数量均高于ITS组,差异具有统计学意义(P<0.05)；LH组细精管上EdU染色的细胞数高于质量浓度为100、10ng/mL的IGF1组,但低于质量浓度为200ng/mL的bFGF组,差异具有统计学意义(P<0.05)；质量浓度为200ng/mL的IGF1组曲细精管上EdU染色的细胞数量高于质量浓度为100和10ng/mL的IGF1组,差异具有统计学意义(P<0.05)；质量浓度为200ng/mL的bFGF组曲细精管上EdU染色的细胞数量高于质量浓度为100和10ng/mL的bFGF组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2)SLC分化实验。不同质量浓度的细胞因子作用21d后,各处理组曲细精管培养基上清液中睾酮含量之间差异有非常显著性(F=77.888,P=0.000)。对各处理组做组间比较后发现：LH组、质量浓度为100ng/mL的IGFl组、质量浓度为100ng/mL的bFGF组上清液中睾酮含量高于ITS组,差异具有统计学意义(P<0.05)；质量浓度为200、10ng/mL的IGF1组上清液中睾酮含量低于LH组,质量浓度为100ng/mL的IGF1组上清液中睾酮含量高于LH组,差异具有统计学意义(P<0.05)；质量浓度为100ng/mL的IGF1组上清液中睾酮含量高于质量浓度为200和10ng/mL的IGF1组,差异具有统计学意义(P<0.05)；质量浓度为100ng/mL的bFGF组上清液中睾酮含量高于浓度为200和10ng/mL的bFGF组,差异具有统计学意义(P<0.05)。从曲细精管样品中检测LC雄激素合成通路各个关键酶RNA的表达,用Western-Blot方法测定LC雄激素合成通路各个关键酶蛋白的表达情况；同时对曲细精管样品做3β-HSD染色并观察染色阳性的细胞数,结果得到同样的验证。4讨论4.1成功构建活体大鼠ALC敲除模型和体外培养的曲细精管ALC敲除模型实验结果显示,将EDS对大鼠进行单次腹腔注射后,该药物可以选择性诱导大鼠睾丸中ALC凋亡,因而显著降低大鼠血清中睾酮的水平。这个过程从注射EDS第1天即开始,并持续7～14d。ALC被敲除后,曲细精管表面的SLC可以重新增殖并向ALC分化。在分化的过程中,新生的LC也可以表达合成雄激素的酶,成熟的ALC可以合成睾酮。整个ALC再生以及分泌雄激素的过程持续约56d,与青春期ALC的增殖分化过程相似。因此证明活体大鼠ALC敲除模型构建成功。实验结果显示,将EDS处理后7d的大鼠曲细精管进行体外培养,使用ITS培养基和添加LH后,均可以在培养基上清液中测出睾酮。28-63d,睾酮值呈现先增加,后减少的峰值模式,ITS+LH组培养基上清液中的睾酮含量较ITS组显著增高。结果说明,EDS对曲细精管表面SLC没有影响,SLC可以增值并向ALC分化。外源性因子LH可以诱导SLC的增殖,并最终形成具合成和分泌睾酮能力的ALC。因此证明体外培养的成年大鼠曲细精管ALC敲除模型构建成功。利用这两种模型可以进行生长因子及其受体抑制剂对SLC增殖和分化的影响,可以从分子层面研究其作用机理,为PADAM患者的新型治疗方法提供理论依据。4.2bFGF和IGF1对活体大鼠睾丸间质细胞再生及睾酮分泌的影响从实验结果得知,除对睾丸的质量和睾酮分泌有影响外,EDS的作用同时也会引起肝脏、肾脏等重要器官质量的下降,而且随着时间延长也没有恢复的迹象。而肝脏、肾脏质量的减少是否也可能跟细胞的凋亡导致实质细胞数量减少有关,仍需待进一步的研究证实。bFGF和IGF1对肝脏质量、双肾质量的恢复无明显作用,EDS、bFGF、FGFR1/2特异性抑制剂PD166866、IGF1、IGFR和特异性抑制剂PPP对FSH的分泌无明显影响。通过睾丸的病理切片及LHR免疫组化检查可发现,bFGF是通过促进睾丸实质细胞数量的增加从而增加睾丸的质量。IGF1组的促细胞增殖作用没有bFGF组显著。在EDS处理第14、21d时,虽然睾丸的质量已经上升,但睾酮的含量尚未恢复,这说明bFGF在这个时间点虽然已促进SLC分化,但特有的类固醇合成细胞分子标志以及睾酮合成酶系尚相对不足,导致睾酮合成能力还未完全恢复,但是它们却为SLC向ILC、ALC阶段分化做足了储备。因此bFGF组到了第35、56天,IGF1组要到第56天,睾酮合成能力才出现显著上升。由于ALC是产生睾酮的主要细胞,遂可以推断bFGF和IGF1均可促进大鼠睾丸中ALC数量增殖。PD166866和PPP对促SLC增殖、分化有一定的抑制作用,但2种因子和受体之间的相互作用机制还需进一步探讨。受体抑制剂可能只是减缓LC的分化速度,但并不会完全抑制SLC向ALC的发育。与生理盐水组比较,bFGF组的睾丸质量在14、21、35d显著上升,而56d时,睾丸质量无明显差异；对睾丸StAR蛋白的影响也出现同样的效应,这说明bFGF对LC的促增殖、分化的作用主要在SLC-PLC-ILC阶段,对已经分化成熟的ALC的作用不显著。4.3bFGF和IGF1对体外培养的大鼠曲细精管中睾丸间质细胞再生及睾酮分泌的影响EDS对SLC没有影响。外源性因子如LH可以诱导SLC的增殖,并最终形成具合成和分泌睾酮能力的ALC。EDS、ITS和LH是构建在离体培养的大鼠曲细精管模型必不可少的试剂。这些分离好的曲细精管中的管周细胞及支持细胞可以在DMEM培养基中存活最长150do将ALC敲除后,我们能在正常条件下将曲细精管表面的SLC诱导分化成ALC。重新生成的ALC可以表达3β-HSD阳性及产生和分泌睾酮。bFGF和IGF1能够促进曲细精管上包括SLC在内多种细胞的增殖,促增殖的能力与细胞因子的浓度呈正比；bFGF和IGF1能够促进EDS处理大鼠的睾酮分泌,增加StAR蛋白表达,说明bFGF和IGF1可诱导SLC向LC细胞系方向分化。但较高质量浓度的bFGF和IGF1反而会抑制睾酮的生成,bFGF的作用明显高于IGF1。本研究为PADAM患者在于细胞治疗方面提供了新的方向,同时也扩大了细胞因子的临床应用前景。