茶氨酸是茶叶中特有的游离氨基酸,广泛应用于食品、医药、保健等行业。茶氨酸现行的生产方法为提取法和酶法,工艺复杂、成本高;随着其市场容量的扩张,开发简单易行、低成本的生产方法具有重要的现实意义。本文以谷氨酸棒杆菌野生型菌株ATCC 13032和一株谷氨酸高产菌GDK-9出发,通过代谢工程手段构建出高产茶氨酸的工程菌株。并进行了发酵生产与产品分离提取方面的研究。有报道称甲基营养菌的γ-谷氨酰甲胺合成酶（GMAS）,对乙胺的亲和性也较高,能够在消耗ATP的条件下催化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸。本文选择来源于甲基营养菌Methylovorus mays、Methylobacterium extorquens、Methyloversatilis universalis、Methylocella silvestris的四种gmas基因,分别命名为gmas Mm、gmas Me、gmas Mu和gmas Ms;通过密码自优化后在ATCC 13032和GDK-9中表达。此时,谷氨酸棒杆菌细胞自身表达GMAS酶,同时合成前体物谷氨酸和实现ATP再生,只要在培养液中添加另一前体物乙胺即可合成茶氨酸。摇瓶发酵结果表明,除表达GMASMs外,其他菌株均产生了高浓度的茶氨酸;过表达相同GMAS酶的GDK-9比ATCC 13032产生了更多的茶氨酸;过表达GMASMm时两菌株的茶氨酸产量最高。进行了SDS-PAGE与GMAS酶活测定,结果显示GMASMm活性最高,其次为GMASMe和GMASMu,GMASMs以包涵体的形式存在;这与发酵结果相吻合。摇瓶实验结果显示两株谷氨酸棒杆菌培养液中均积累了一定浓度的谷氨酸,为了降低副产物谷氨酸的分泌,以及促进胞内茶氨酸的合城,敲除两菌株的谷氨酸输出蛋白Ncgl1221。摇瓶发酵结果表明,两株菌胞外谷氨酸的积累均大幅下降,推测发酵后期由于菌体裂解导致少量谷氨酸外流;敲除谷氨酸输出通道后,GDK-9茶氨酸产量显著提高。为了在微生物宿主中建立完整的茶氨酸合成途径,需要首先构建乙胺的胞内合成途径。为此,在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基础组上整合3拷贝GMASMm和来源于枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶基因ald Bsu,获得出发菌株The3Ala。已有研究表明,茶树中乙胺由丙氨酸脱羧产生,因此在该出发菌株中表达来源于茶树和拟南芥的丝氨酸/丙氨酸脱羧酶Ala DC,但是在本实验室的条件下并没有检测到茶氨酸的生成。SDS-PAGE结果显示植物来源的Ala DC以包涵体形式存在。将最佳菌株在5 L发酵罐中进行了茶氨酸发酵生产,最终产生了约42 g/L茶氨酸,糖酸转化率约为19.6%。对发酵液中的茶氨酸进行了分离提取,经过微滤和纳滤膜过滤、活性炭脱色、离子交换吸附、浓缩结晶和干燥步骤,茶氨酸收率约67%,产品纯度达到98%。本研究首次构建了添加乙胺的微生物发酵法茶氨酸生产菌株,并且开发了茶氨酸高效发酵生产和产物提取工艺。该方法操作简单、成本低,生产技术具有较好的经济可行性和工业应用潜力。