1,5-二磷酸核酮糖羧化酶-加氧酶和乙醇酸氧化酶关系的研究

来源 :华南师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:woheni187170713
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乙醇酸氧化酶(ECl.1.3.15,GO)是植物光呼吸的关键酶。蛋白和基因水平均证实,GO只含一种40kD亚基,但GO却具有多个等电点。从绿叶中提取GO,在向正极泳动的SDS-PAGE中只出现40kD,其phe含量极低,以至不能被测定出来;而在SDS-醋酸纤维素薄膜电泳中却出现向正极和负极泳动的两种蛋白。向正极泳动的是GO40kD亚基;而向负极泳动的则是碱性的富含phe的蛋白(PPGO,phe-rich protein),PPGO的phe在60%-65%。我们实验室初步证实,PPGO包裹GO形成PPGO-GO复合蛋白,导致PPGO-GO复合蛋白在258nm有吸收峰,以及ppGO-GO复合蛋白抗体只识别PPGO而不识别G040kD亚基,GO40kD亚基只被其自身抗体所识别。因此,PPGO-GO复合蛋白抗体只与PPGO有关,与GO无关。PPGO-GO复合蛋白抗体识别绿叶粗蛋54kD/14kD等带。由于1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(EC 4.1.1.39,Rubisco)的rbcS/rbcS(rbcL/rbcS)的分子量也是54kD/14kD,且占绿叶总蛋白的50%-60%,故识别54kD/14kD可能与rbcL/rbcS有关。 由于PPGO-GO复合蛋白抗体与GO无关,且GO无论在结构和细胞定位上,均与Rubisco完全不同,以上54kD/14kD等带的免疫交叉反应与GO无关。另外,PPGO和Rubisco的氨基酸组成完全不同,PPGO和Rubisco两者也不太可能产生免疫交叉反应。除非Rubisco也被同一PPGO所包裹,PPGO和Rubisco也组成PPGO-Rubisco复合蛋白,并且在SDS-变性处理后,而Rubisco解离为rbcL/rbcS,但rbcL/rbcS仍和PPGO结合在一起,分别形成PPGO-rbcL和PPGO-rbcS,PPGO-GO复合蛋白抗体才能通过PPGO而间接识别54kD/14kD的rbcL和rbcS。 为证实以上推测,本文以氨基酸组成测定和免疫杂交为主要手段,对PPGO-GO复合蛋白和Rubisco的关系、Rubisco是否被同一PPGO所包裹,以及rbcL/rbcS是否仍和PPGO结合在一起等进行研究: 从菠菜绿叶中提取的Rubisco,具有Rubisco活性,在Native-PAGE中呈一条约560kD条带,在SDS-PAGE中呈现54kD/14kD两条带,表明该Rubisco的电泳特性与报告的一致。 提取的Rubisco经SDS-醋酸纤维素薄膜电泳,出现向正极和负极泳动的两种蛋白。SDS-PAGE后,从负极缓冲液中获得向负极泳动的蛋白PPrbc,其phe含量在64%。因此,提取的Rubisco中还含有PPrbc,我们称之为PPrbc-Rubisco,无论氨基酸组成和向负极泳动,PPGO和pprbc都很相似,同时,免疫反应表明,PPGO抗体也识别PPrbc,表明PPGO和pprbc是同一蛋白。如果PPrbc也包裹Rubisco,pprbc-Rubisco经SDS-PAGE,Rubisco解离为rbcL/rbcS,但仍和pprbc结合在一起,出现pprbc-rbcL和PPrbc-rbcS那么,PPGO-GO复合蛋白抗体可以通过pprbc识别rbcL/rbcS。 事实也表明,PPrbc-Rubisco经SDS-PAGE,从正极的凝胶中分别获得的54kD/14kD蛋白,其phe含量为7.65%/24.24%,而菠菜rbcL/rbcS的cDNA编码的rbcL/rbcS的phe含量分别为4.59%和6.61%。54kD/14kD蛋白的phe含量明显高于rbcL/rbcS,表明54kD/14kD蛋白除含有rbcL/rbcS外,还含有一个富含phe的蛋白。有必要用免疫方法研究该蛋白与PPGO和PPrbc的关系。进一步用免疫方法证实,在非SDS变性的Dot b1ot中,PPGO-GO复合蛋白抗体、PPGO抗体、PPrbc-Rubisco抗体、54kD蛋白抗体,以及14kD蛋白抗体均识别PPrbc-Rubisco和PPGO-GO复合蛋白。在SDS-PAGE Western-blot中,以上五种抗体均同样识别54kD蛋白/14kD蛋白。因此,PPrbc和Rubisco紧密结合,形成PPrbc-Rubisco复合蛋白。在SDS处理后,54kD蛋白实际上是pprbcl-rbcL;14kD蛋白是pprbcS-rbcS。 两批提取的PPrbc-Rubisco复合蛋白经SDS-PAGE后经考马斯亮蓝染色,均呈现54kD/14kD两条带,但pprbc-rbcL抗体(即P54kD蛋白抗体)只识别其中一条54kD。而另一条54kD可能是rbcL,即PPrbc可能已经从rbcL中完全解离下来,此时的54kD已经不含PPrbc,导致不被pprbc-rbcL抗体所识别。因此,54kD有时含PPrbc;而有时不含PPrbc,导致前人报的rbcL/rbcS的抗体有时存在;而有时不存在免疫交叉反应。
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