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基因消除PCR (Removing PCR; R-PCR)技术是一种将聚合酶链式反应(PCR)技术和限制性核酸内切酶技术相结合的用以消除两个基因群体中的非目标基因从而获得目标基因的技术。与现有的筛选基因群体中目标基因的方法(抑制性差减杂交,基因芯片,高通量测序)相比,该方法具有操作较为简单,假阳性率低,成本低廉,稳定性好,可重复性高,适用范围广等优点。玉米纹枯病是由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani KUhn)引起的,在中国该病已成为制约玉米产量的主要病害。从转录组水平研究纹枯病菌诱导后玉米体内基因的差异表达,是从基因水平阐释玉米对纹枯病抗性机制的有效途径,从而为培育广谱、高效、稳定、持久抗病性品种提供理论基础。本研究提出了基因消除PCR技术的概念,初步建立起了单基因片段水平R-PCR和多基因水平R-PCR,试图为筛选基因群体中的目标基因提供一种新的技术手段。同时,将R-PCR技术成功运用到纹枯病菌诱导玉米差异表达基因的筛选中,为建立相关抗病基因表达谱和从全基因表达水平上深入探索玉米对纹枯病的系统抗病机制奠定基础。本实验以玉米自交系Y478和立枯丝核菌高致病性融合菌群AG-1-IA为研究对象,分别采集接种纹枯病菌6h,12h,24h,36h,48h,60h和72h的叶片,将该7个时间点取的叶片作为混合样本,利用R-PCR技术筛选出该样本相对于未受侵染的玉米叶片而言上调表达的基因,并采用荧光定量PCR技术对部分基因进行验证,获得主要结果如下：1.以小麦小GTP结合蛋白基因片段为起始材料,基本建立起了单基因片段水平的R-PCR,并验证了R-PCR引物的特异性,证明了R-PCR技术在原理上是可行的。2.以玉米Y478基因组DNA为起始材料,在单基因片段水平R-PCR的基础上进一步优化建立起多基因水平R-PCR,并取得较好的消除效果,进一步证明了R-PCR技术的可行性和高效性。3.以接病的Y478cDNA和未接病的Y478cDNA为起始材料,采用R-PCR技术,获得纹枯病菌诱导玉米上调表达基因片段的R-PCR产物。将该R-PCR产物进行群体T-A克隆,得到的122个阳性克隆经过测序分析,获得53条唯一的EST序列。4.将筛选得到的53条EST序列提交到Genbank中进行Blast比对分析,其中41条EST序列对应基因的功能是已知的,剩余12条EST序列无基因功能注释。对筛选到的差异表达且功能已知的基因根据相关文献进行简单的分类,发现其中有8个基因与抗病、防御反应直接相关,其它33个基因在纹枯病菌与玉米互作中的作用,有待进一步的研究。5.对41条对应基因功能已知的EST序列中的23条序列设计荧光定量引物,对它们在接种纹枯病菌的玉米体内和健康玉米体内的表达量进行相对定量。其中14条EST序列所对应的基因被纹枯病菌诱导显著上调表达,另外9条EST序列所对应的基因上调表达倍数小于2。