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目的 1、构建可被放射线激活而转录的早期生长反应基因-1（Egr-1）启动子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（herpes simplex virus thymidine kinase gene HSV-tk简称为tk）pET（pCL-neo-Egr-1-tk）。 2、利用脂质体将重组真核表达载体pET质粒转染人肝癌细胞株SMMC-7721，研究其在60Co-γ射线照射后在肝癌细胞中的表达以及在前药丙氧鸟苷（ganciclovirGCV）作用下体外对肝癌细胞的杀伤作用， 3、将转染了pET的人SMMC-7721肝癌细胞种植于balb／c裸小鼠皮下，建立裸鼠肝癌移植瘤模型，研究放射线诱导性自杀基因（pET）在射线作用下体内对肝癌的治疗作用。 方法 1、将含有tk基因的质粒pHSV-106经限制性内切酶EcorⅠ和PvuⅡ酶切后，获得长度为1.9kb的tk基因片段，同时将含有放射线诱导性启动子Egr-1的重组真核表达载体pEO质粒经限制性内切酶XbaⅠ酶切，经klenow酶补平，再经Ecor1酶切后获得含有Egr-1启动子的开环片段，将此片段与tk基因进行相同突出端的连接反应，构建成重组真核表达质粒pCl-neo-Egr-tk，自命名为pET，并酶切鉴定其方向正确。同时将tk基因片段定向插入真核表达载体pCl-neo中。构建以CMV为启动子的重组真核表达质粒pCl-neo-CMV-tk，自命名为pCT，作为对照质粒。 2、体外培养人肝癌细胞株SMMC-7721，将pET、pCT、pCl-neo质粒用lipofectamine分别进行脂质体介导的DNA转染，转染人SMMC-7721肝 南京医科大学博士学位论文癌细胞株，转染后的细胞用 G4选择培养基选择培养，扩增收集抗性克隆细胞并分别命名为S删C用T、S＊MC汇T、SMMOCL细胞，将SMMC／ET卓胞分另取 0、5、75、10、15、20Gy 6个齐量进行‘’CO－y射线照射24hr后进行RTPCR半定量分析，vX OGy作为对照检测各不同剂量组比基因的 mRNA的表达。并将 S删CJ72、S删C／CL、S删CaT、S删C／ET四组细胞以 10Gy剂量进行‘忙O－y射线照射，将未转染的S删C刁 细胞作为对照，照射12hr后加入前药丙氧鸟旮（gancicloviGCV），MTT法检测细胞生存率，了解放射线诱导性自杀基因在体外对肝癌细胞的杀伤作用。3、分别将 SMMC－772、SMMC／CL、SMMC／CT、SMMC／ET四组细胞接种于 balb／c裸。J、鼠皮下，每组 6 R，共24只；建立，J、鼠肝癌移植瘤模型，并以 S删Cj72组作为对照，待肿瘤长至直径约 0．6cm时，分两次间隔24小时行剂量为 10Gy的肋C小 v射线照射，同时动物腹腔内注射前体药物 GCw25mg／kg／只卜并观察各组动物肿瘤生长情况，测量肿瘤大，J、，连续注药14天后，颈椎脱臼法处死动物，挖取各组动物瘤体称重，了解治疗效果并在光镜下观察肿瘤的病理结果变化。 结果1、真核表龈粒扯T经 Ecor和 PvJ酶切鉴定后。证明其方向正确。2、S删C／ET肝癌细胞株经不同剂量的‘忙O叫射线照射后，ti RTICR半定量分析 imnon的表达分别为 SGy（75．sl6．5）％、7．SGy（74．4 t7．引O、10Gy（104．8 t 4．6）O、15Gy（117．2ill．1）o、20W（76．st7．4）0均明显高于对照组 O邱（55．2 i 7．2）0巾0．001卜其中尤以剂量为15Gy最为显著。四组细胞SMMC－7721、SMMC／CL、SMMC／CT、SMMC／ET在y射线照射后，在前药GCV作用下，MTT法检测各组i田胞生存率，tk果显示，与对照组相比，S MMMMC用T、S＊MCCT细胞的生存率均显著降 4 南京医科大学博士学位论文低（分别为8％和17％八P二O刀OO），而S MMMMC用T细胞的生存率也显著低于S MMMMCCT细胞（P—O．0O8），S MMMMC汇L细胞的生存率与对照组相比差异无显著意义。该结果提示经‘七小 Y射线照射后可被放射线转录激活的匆d启动子可引起出基因在肝癌细胞中高效表达，从而在前药作用下在体外可明显提高对肝癌细胞的杀伤效率。3、上述四组细胞接种balb／c裸。J、鼠，24 R，J、鼠均成功长出肿瘤，四组动物成瘤潜伏期无差异（p－0．596），成瘤率为 100o，治疗前卜忙O－y射线照射－GCV）四组动物瘤体大小无差异中刃．735)，治疗后，无论是肿瘤体积还是瘤体重量，S删C／ET和SMMCCT组均明显，J、于SMMCCL和S删C厂72组，同时 S删C／ET组瘤体体积和重量亦明显。J、于 SMMCCT组（p＜0．05）。SMMC／CL，SMMC／CT和S删C压T组平均肿瘤抑牛率分别为刀．4O、65．6o和 85．9O，提示伙基因本身对肝癌的杀伤作用，同时表明 Egr刁启动子可被 Y射线激活而转录从而使下游 tk基因大量表达，在体内可明显抑制肿瘤生长。 结论1、构建的放射线诱导性真核表达载体 pET在朋C小 v射线外照射作用下，可激活 Egrl启动子，引起 tk基因在肝癌细胞中高效表达并呈剂量依赖性。2、可被测线激活而转录的放射线诱导性启动子Egrl可驱动tk基因在