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由香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)引起的香蕉束顶病是危害香蕉产业发展的一种重要病毒性病害。BBTV是矮缩病毒科(Nanaviridae)香蕉束顶病毒属(Babuvirus)的代表成员。BBTV基因组至少由6个主要基因组分,有些分离物还含有2～3个同源性卫星组分(satellite component)。其中DNA-R编码的复制起始相关蛋白(Replication initiation protein,Rep)在病毒基因组6个必须组分的滚环复制时起剪切和连接作用,而卫星组分编码的复制起始辅助相关蛋白(Assistantreplication initiation protein,RepA)只能够对自身组分的颈环结构区域进行剪切和连接。本研究以含有S4卫星组分的BBTV海口分离物(B2)为材料,通过对DNA-R和S4组分编码蛋白进行序列分析和功能预测,运用亚细胞定位技术明确了 Rep、RepA在本生烟叶片细胞中的定位情况;通过与GFP基因融合和农杆菌侵染本生烟,鉴定了Rep和RepA基因非编码区)(Untranslated Region,UTR)是具有启动子功能;通过焚光定量PCR分析RNA/DNA比例,确定该基因启动子的相对活性(与35S启动子相比)。取得以下结果:(1)PCR克隆Rep基因和RepA基因并进行氨基酸序列相似性分析,发现Rep和RepA蛋白在其N端均含有一个保守的与病毒复制相关的结构域(Viral-Rep domain),参与病毒基因组的剪切和连接。基于该结构域预测Rep和RepA蛋白定位在细胞核中;另外,Rep和RepA蛋白在其C端均含有一个保守的P-loop-NTPase结构域,可能在对病毒基因组的复制中提供主要能量。(2)为探究BBTV Rep、RepA基因所编码蛋白在植物体内发挥其功能的亚细胞位置,通过PCR扩增获得了 Rep基因的876bp和RepA基因的852bp全长核苷酸序列,分别插入到到GV1300载体中GFP基因上游形成融合表达载体pCAMBIA1300,通过农杆菌介导方法在本生烟叶片表皮细胞中表达,共聚焦显微镜下观察绿色荧光,发现Rep-GFP和RepA-GFP融合蛋白均分布在本生烟叶片表皮细胞的细胞核中,结果说明BBTV Rep和RepA蛋白在本生烟叶肉细胞中均定位于细胞核。(3)为探究BBTVRep、RepA基因的UTRs启动下游基因转录的功能,,利用重叠PCR将Rep、RepA基因UTRs分别和下游GFP基因融合,其产生的融合RepQ-GFP和 RepQA-GFP 序列分别包含了 387bp 的 Rep UTR(+743～+24)和 360bp 的RepA UTR(+768～+24),并构建到pCAMBIA3300载体中。通过农杆菌介导方法在本生烟叶片表皮细胞中表达,共聚焦显微镜观察显示,连接有Rep、RepA基因UTRs的GFP基因在本生烟叶片细胞的细胞核和细胞质中有明显绿色荧光,说明其具有启动下游基因转录的功能。(4)为了解Rep和RepA基因UTRs的启动子相对活性,分别对农杆菌介导的本生烟叶片的GFP基因DNA含量和RNA表达量进行荧光定量PCR分析。结果表明:与35S的启动子活性相比,Rep基因启动子相连的GFP基因的RNA/DNA比值为0.345,而RepA基因启动子相连的GFP基因的RNA/DNA比值为0.696。由此可知,RepAQ的启动子活性高于RepQ启动子,分别是35S启动子活性的70%和35%左右。本研究明确了 BBTV Rep和RepA在本生烟细胞中的定位情况和启动子功能,为进一步研究其作用机理奠定了重要的科学基础。