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肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pneumoniae)是一种常见的革兰氏阳性机会致病菌,是社区获得性肺炎的重要病原菌。在发展中国家,每年有近百万儿童死于肺炎性疾病。除了儿童,老年人和免疫功能不全的人群也都处于肺炎链球菌感染的危险之中。肺炎链球菌感染可以引起鼻窦炎、中耳炎、肺炎、败血症和脑膜炎等相关疾病。近年来,各种抗生素的耐药菌不断出现和广泛传播,使新型机制抗感染药物的研发十分紧迫。随着对病原菌致病过程的深入了解,抗毒力策略研究显得尤为重要。抗毒力策略是以细菌的毒力因子为靶标,通过干预细菌的致病过程以达到抗感染的目的。天然化合物是新药研发的重要资源库,通过溶血抑制试验和荧光共振能量转移试验(FRET),本研究筛选到了一种可以同时抑制肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin,PLY)和分选酶A(Sortase A,SrtA)两种毒力因子生物学活性的天然化合物,即表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)。EGCG是绿茶茶多酚中的主要活性成分,具有抗氧化、抗炎和抗癌等多种生物药理学活性。药敏试验结果表明,EGCG对肺炎链球菌D39的最低抑菌浓度大于≥2234μM(1024μg/ml)。成孔毒素PLY是肺炎链球菌的重要毒力因子之一,在肺炎链球菌致病过程中发挥着非常重要的作用。PLY单体可以在富含胆固醇的细胞膜上寡聚,形成圆形的跨膜大孔,使细胞内容物外溢,从而导致细胞裂解。PLY的细胞毒性即与其溶细胞活性相关,并且直接与肺炎链球菌的致病性相关。本研究通过原核表达和纯化获得了PLY重组蛋白。溶血活性抑制试验和蛋白质免疫印迹试验结果表明,EGCG不影响肺炎链球菌内PLY的表达,但是可以直接抑制PLY的溶血活性。在PLY与人肺泡上皮细胞(A549)的共同孵育体系中加入EGCG,可显著降低PLY介导的细胞损伤。在体外PLY寡聚化形成体系中加入EGCG,可明显抑制PLY寡聚体的形成。上述结果表明,EGCG可直接作用于PLY本身而抑制其成孔活性。srta是肺炎链球菌的另一重要毒力因子,是广泛存在于革兰氏阳性菌细胞膜上的一种转肽酶。通过识别和切割lpxtg序列,srta可以将许多致病相关的表面蛋白锚定于细胞壁的肽聚糖上。srta的活性直接与肺炎链球菌的致病性相关。本研究通过原核表达和纯化获得了srtaΔn81和nana重组蛋白;分别免疫balb/c小鼠后,获得抗srtaΔn81和nana的高效价血清;通过荧光共振能量转移试验检测了egcg对srta活性的影响。结果发现,egcg可剂量依赖性地抑制srta的肽酶活性;在肺炎链球菌培养液中加入不同浓度egcg不影响肺炎链球菌内srta的表达水平,但可剂量依赖性地降低细菌表面nana的含量;egcg与肺炎链球菌共培养可显著降低细菌生物被膜的形成;在肺炎链球菌与人喉癌上皮细胞(hep2)共培养体系中加入egcg,可显著抑制肺炎链球菌对hep2细胞的粘附作用。以上结果表明,egcg通过直接与srta相互作用抑制肺炎链球菌内srta的转肽酶活性。通过滴鼻法,我们建立了肺炎链球菌感染小鼠肺炎模型,并通过皮下注射egcg对感染小鼠进行治疗。结果发现,egcg可明显延长感染小鼠的存活时间,显著降低感染小鼠肺部的细菌定殖数;整体和组织病理学观察显示,与对照组相比,egcg治疗组小鼠肺部的病理性损伤明显减轻;另外,治疗组小鼠的肺湿重/干重比值显著降低,表明egcg可缓解感染小鼠的肺水肿症状。体内外功能试验结果表明,egcg可通过与ply和srta相互作用抑制其生物学活性,从而降低肺炎链球菌的致病性。最后,本研究应用分子对接和分子动力学模拟等计算生物学方法,分别获得了egcg与ply和srta的结合模式及结合位点。结果显示,egcg通过氢键和疏水作用结合于ply第3结构域和第4结构域之间的凹槽,并与ply的ser256、glu277、tyr358和arg359形成较强的相互作用;另外,egcg还可以结合于srta的“活性”区,并与srta的thr169、lys171和phe239形成较强的相互作用,从而封闭活性中心。通过定点残基突变试验,我们将这些结合位点的氨基酸分别突变为丙氨酸(ala),并且检测了egcg对这些突变子活性的影响。结果显示,egcg对ply突变子(ply-e277a、ply-y358a和ply-r359a)溶血活性和细胞毒性的抑制作用明显降低,对srtaΔn81突变子(srtaΔn81-t169a、srtaΔn81-k171a和srtaΔn81-f239a)肽酶活性的抑制作用也明显降低。以上实验结果表明,上述氨基酸残基突变影响了EGCG与PLY和SrtA的相互作用,这也进一步验证了分子动力学模拟结果的可靠性。综上所述,本研究为天然化合物抗感染机制研究提供了重要实验依据,并且为以PLY和SrtA为靶标进行肺炎链球菌抗毒力药物研究奠定了基础。