大肠埃希氏菌（Escherichia coli,E.coli）是一种革兰氏阴性细菌,是人和其他哺乳动物正常肠道菌群的重要组成部分,同时也是一个高度多样化甚至会导致死亡的病原菌,能够引起一系列疾病。模式识别受体（pattern recognition receptor,PRRs）包括 TOLL 样受体（Toll-like receptor,TLRs）和 NODE 样受体（Node-like receptor,NLRs）,在宿主对抗入侵病原体的早期应答中识别特定的病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern,PAMPs）或损伤相关分子模式（Damage-associated molecular pattern,DAMPs）。革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）能够激活巨噬细胞以及树突状细胞等免疫细胞的TLR4引起宿主炎症反应。大量证据表明TLR2作为一种PRR在介导多个微生物感染性疾病的发展过程中发挥广泛的病理性作用。TLR2和TLR4在宿主对大肠杆菌感染的应答中均发挥重要作用。NLRP3炎性小体是目前最具代表性的炎性小体,对多种物理和化学刺激均有反应,失控时可导致一系列疾病。然而NLRP3炎性小体是否参与大肠杆菌感染的先天免疫反应仍不清楚。本研究旨在证明NLRP3炎性小体是否与TLR2和TLR4一样在大肠杆菌感染机体引起的炎症反应中发挥作用,具体的研究内容如下:第一部分:研究TLR2、TLR4及NLRP3在小鼠腹腔巨噬细胞感染大肠杆菌过程中的作用:（1）采用流式细胞术检测NLRP3在LPS、Braun脂蛋白（Braun lipoprotein,BLP）、E.coli DH5α（标准菌株）和E.coli JE5505（BLP脂蛋白缺失菌株）分别刺激野生型小鼠（wildtype,WT）、TLR2^-/-及TLR4^-/-后,检测鼠腹腔巨噬细胞相关因子的表达量,结果显示,NLRP3在LPS、BLP、E.coli DH5α和E.coli JE5505分别刺激WT、TLR2/-及TLR4^-/-小鼠腹腔巨噬细胞后表达量与对照组相比显著上升;（2）采用ELISA法检测炎症相关因子（促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β,抗炎性细胞因子IL-10和趋化因子RANTES）在WT、TLR2^-/-TLR4^-/-和NLRP3^-/-小鼠腹腔巨噬细胞中的分泌量,结果显示,TNF-α和IL-1β在LPS、BLP、E.coli DH5α和E.coli JE5505分别刺激后的TLR2^-/-、TLR4^-/-和NLRP3^-/-小鼠腹腔巨噬细胞中的分泌量与WT小鼠腹腔巨噬细胞相比显著降低;（3）采用 Western Blot 法检测 LPS、BLP、E.coli DH5α 和E.coli JE5505分别刺激WT、TLR2^-/-、TLR4^-/-和NLRP3^-/-小鼠腹腔巨噬细胞后MAPK、NF-κB以及caspase-1信号通路的激活情况,结果显示,与WT小鼠腹腔巨噬细胞相比TLR2^-/-TLR4^-/-和 NLRP3^-/-小鼠腹腔巨噬细胞 MAPK、NF-κB 以及 caspase-1 信号通路的激活降低;（4）采用实时荧光定量PCR法和Western Blot法检测LPS、BLP、E.coli DH5α 和E.coli JE5505 分别刺激 WT、TLR2^-/-、TLR4^-/-和 NLRP3^-/-小鼠腹腔巨噬细胞后COX-2的表达量,结果显示,与WT小鼠腹腔巨噬细胞相比LPS、BLP、E.coli DH5α和E.coliJE5505分别刺激的TLR2^-/-和TLR4^-/-小鼠腹腔巨噬细胞COX-2的表达量显著降低,而NLRP3^-/-小鼠腹腔巨噬COX-2的表达量在BLP、E.coliDH5α和E.coli JE5505组显著低于WT小鼠腹腔巨噬细胞。第二部分研究了 TLR2、TLR4及NLRP3在小鼠感染大肠杆菌过程中的作用。LPS、BLP、E.coli DH5α和 E.coli JE5505 分别注射于 WT、TLR2^-/-、TLR4^-/-和NLRP3^-/-小鼠腹腔:（1）采用ELISA法检测炎症相关因子（促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β,抗炎性细胞因子IL-10和趋化因子RANTES）在WT、TLR2^-/-TLR4^-/-和NLRP3^-/-小鼠血清中的分泌量,结果显示,TNF-α和IL-1β在LPS、BLP、E.coli DH50和E.coli JE5505分别刺激后的TLR2^-/-、TLR4^-/-和NLRP3^-/-小鼠血清中的分泌量与WT小鼠相比显著降低;（2）采用实时荧光定量PCR法和免疫荧光法检测LPS、BLP、E.coli DH5α和E..coliJE5505分别刺激WT、TLR2^-/-、TLR4^-/-和NLRP3^-/-小鼠后肝脏中HMGB1的表达量。结果显示,LPS、E.coli DH5α和E.coli JE5505 分别刺激TLR2^-/-TLR4^-/-和NLRP3^-/-小鼠后肝脏中的HMGB1表达量显著低于WT小鼠肝脏中的表达量、BLP刺激TLR2^-/-和NLRP3^-/-小鼠后肝脏中的HMGB1表达量显著低于WT小鼠肝脏中的表达量;（3）E.coli DH5α 感染 WT、TLR2^-/-TLR4^-/-和 NLRP3^-/-小鼠后,利用台式干燥化学分析仪检测血清中谷草转氨酶（aspartatetransaminase,AST）和谷丙转氨酶（alanine transaminase,ALT）的含量变化;采用H&E染色法观察小鼠肝脏病理性损伤,结果显示,TLR2^-/-、TLR4^-/-和NLRP3^-/-小鼠与WT小鼠比较,血清中AST和ALT的含量显著降低以及肝脏细胞的空泡变性程度减弱。以上结果提示TLR2、TLR4和NLRP3炎性小体在大肠杆菌感染小鼠腹腔巨噬细胞引起炎症相关因子分泌、相关信号通路激活以及COX-2表达过程中发挥重要作用;TLR2、TLR4和NLRP3炎性小体在大肠杆菌感染小鼠引起炎症相关因子分泌、肝脏中HMGB1的表达以及肝脏损伤过程中发挥重要作用。综上所述,除了 TLR2和TLR4之外NLRP3炎性小体也参与大肠杆菌诱导的炎症反应。