研究目的:寻找可以使肌肉特异性受体型酪氨酸激酶(Muscle,skeletal receptor tyrosine-protein kinase,MuSK)去磷酸化的酪氨酸磷酸酶,探究MuSK的酪氨酸磷酸化位点及受该酪氨酸磷酸酶调节的酪氨酸位点,探讨该酪氨酸磷酸酶通过使MuSK去磷酸化对乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)富集的调节作用,拓展MG病因研究,并为治疗提供新的靶点及思路。研究方法:用10种酪氨酸磷酸酶质粒与MuSK质粒共转染HEK293细胞,通过蛋白质免疫印迹及免疫沉淀技术筛选出可使MuSK去磷酸化的酪氨酸磷酸酶,免疫共沉淀检测该酪氨酸磷酸酶是否能与MuSK形成蛋白复合物;Flag-MuSK质粒转染HEK293细胞,Flag-Beads富集、纯化MuSK蛋白后行聚丙烯酰氨凝胶电泳,考马斯亮蓝染色并回收MuSK蛋白,行质谱分析以检测MuSK蛋白的酪氨酸磷酸化位点;根据质谱结果,运用点突变技术构建单/多位点突变的MuSK质粒,突变质粒与筛选出的酪氨酸磷酸酶质粒共转染HEK293细胞,行蛋白质免疫印迹确定该酪氨酸磷酸酶使MuSK去磷酸化的酪氨酸位点;利用慢病毒包装技术,构建该酪氨酸磷酸酶野生型/突变型过表达的C2C12细胞系,C2C12细胞长至90%后更换为分化培养基以诱导细胞融合并分化成肌管细胞,用Agrin刺激细胞24h诱导AChR在细胞膜富集,4%甲醇固定并用1 mM的AlexaFluor 555-conjugated alphabungarotoxin标记AChR 24小时,激光共聚焦荧光显微镜下观测荧光标记的肌管细胞,统计AChR富集的数量及长度。通过比较野生型C2C12、野生型酪氨酸磷酸酶高表达C2C12、突变型酪氨酸磷酸酶高表达C2C12的AChR富集,探究酪氨酸磷酸酶对AChR富集的调节作用。研究结果:经过筛选发现,酪氨酸磷酸酶PTPRR可使MuSK显著去磷酸化,免疫共沉淀显示PTPRR可与MuSK形成蛋白复合物;质谱分析表明MuSK蛋白的Y553、Y750、Y754、Y755四个位点的酪氨酸残基可被磷酸化修饰,PTPRR可使其中的Y754位点去磷酸化;经统计表明,高表达野生型PTPRR的C2C12肌管细胞相较于野生型C2C12细胞AChR富集的数量减少、长度变短,而高表达D554A突变型PTPRR的C2C12细胞较于野生型C2C12细胞AChR富集的数量增多、长度变长(数据来源于3次以上实验,每组肌管数量≥45,unpaired t test,P<0.05)。结论:酪氨酸磷酸酶PTPRR可使MuSK去磷酸化,这种作用是通过使MuSK Y754酪氨酸位点去磷酸化实现的,进而抑制MuSK介导的的AChR富集,初步证明PTPRR可参与调节MuSK信号通路,是潜在的MG诊断和治疗靶点。