猪链球菌病和猪圆环病毒病流传广泛,危害性大,给全球的养猪业造成了巨额的经济损失,妨碍了养殖业的发展。研究这两种病的疫苗对其防治有着重大的意义。沙门菌是一种胞内寄生菌,具有强大的侵袭能力,可以在宿主的体内生长,经过减毒后制备成疫苗载体携带外源抗原成为优良的二联菌苗,持续的刺激机体产生高效的细胞免疫和体液免疫应答。本研究利用前期已经构建好的由阿拉伯糖调控载体菌延迟减毒和延迟表达外源抗原,提高针对猪霍乱沙门菌和外源抗原免疫原性的重组减毒沙门菌载体的基础上,以Balb/C小鼠为模型,对来自猪链球菌的三个抗原和猪圆环病毒的二个Cap结构蛋白的免疫原性进行了评价和筛选,为构建有效的猪霍乱沙门菌和猪链球菌,猪霍乱沙门菌和猪圆环病毒二联疫苗提供理论依据。1猪链球菌2型抗原的筛选和重组猪霍乱沙门菌株rSC0016携带猪链球菌抗原的免疫效率比较烯醇化酶(Enolase,Eno)是猪链球菌的一种毒力因子,在猪链球菌对宿主的入侵和转移过程中发挥作用;6-磷酸葡萄糖脱氢酶(6-phosphogluconate-dehydrogenase,6PGD)在多种细菌中具有较高的保守性,能针对猪链球菌的攻击提供一定的保护力;表面抗原A(SurfaceantigenoneA,SaoA)是近年来新发现的猪链球菌高度保守的表面蛋白,在猪链球菌感染机体的过程中主要起到协调各种毒力因子的作用。本课题组在前期的研究中已经成功构建了充分减毒和提高免疫原性猪霍乱沙门菌载体rSC0016;由asd+的原核表达载体pYA3493分别表达猪链球菌的6PGD(pS-6PGD)和SaoA蛋白(pS-SaoA)。因此在本论文中,需要构建由pYA3493表达猪链球菌的Eno蛋白,然后评价重组减毒猪霍乱沙门菌载体rSC0016分别递送猪链球菌的抗原6PGD、SaoA和Eno蛋白的免疫原性。本研究根据猪链球菌2型(SS2,GI:8151617)的Eno基因的序列,设计扩增Eno基因(1305bp)的引物,通过酶切、连接,成功连接到原核表达载体pET28a中,成为pET28a-Eno,然后转化入大肠杆菌BL21中得到BL21(pET28a-Eno);经IPTG诱导表达并纯化获得Eno蛋白;用纯化的Eno蛋白免疫新西兰大白兔得到抗Eno的多抗血清;将Eno基因插入asd+的原核表达载体pYA3493中形成pS-Eno质粒;将质粒pS-6PGD、pS-SaoA和pS-Eno分别转化入重组减毒猪霍乱沙门菌载体rSC0016中,分别得到携带猪链球菌2型6PGD、SaoA和Eno基因的重组减毒猪霍乱沙门菌株rSC0016(pS-6PGD)、rSC0016(pS-SaoA)和 rSC0016(pS-Eno)。经 Western-Blot 检测证明 rSC0016(pS-6PGD)、rSC0016(pS-SaoA)和rSC0016(pS-Eno)可以高效表达对应的蛋白。同时本研究首先检测了含有Eno的减毒猪霍乱沙门菌rSC0016(pS-Eno)在LB中的生长能力;通过口服途径接种对其在小鼠的肝脏、脾脏以及肠道派伊尔氏淋巴结的定植能力进行了检测;随后分别将 rSC0016(pS-6PGD)、rSC0016(pS-SaoA)和 rSC0016(pS-Eno)三种菌苗免疫小鼠,3周后收集阴道冲洗液和血清,随后加强免疫;5周后再次收集血清和阴道冲洗液样品,并用猪链球菌2型对小鼠进行腹腔注射攻毒,评价并比较rSC0016(pS-6PGD)、rSC0016(pS-SaoA)和rSC0016(pS-Eno)的免疫原性与保护性。结果显示,rSC0016(pS-Eno)在LB中的生长速率略慢于空载体组rSC0016(pYA3493)和商用猪霍乱沙门菌弱毒疫苗株rSC0018(pYA3493);定居实验显示,随着时间的延长,rSC0016(pS-Eno)在各脏器上的细菌数量逐渐减少,接种后第14天,肝脾组织分离不到减毒菌株,而弱毒疫苗株rSC0018(pYA3493)则还可以被分离到,表明疫苗菌比弱毒疫苗株毒力更弱;疫苗菌在肠道派伊尔氏结第21天的数量仍有104CFU的菌,而rSC0018(pYA3493)在同一时间内数量为0,表明rSC0016(pS-Eno)在肠道淋巴结的定居能力显著高于rSC0018(pYA3493)株。使用间接ELISA检测小鼠血清和阴道冲洗液中针对SS2的Eno、SaoA和6PGD抗原产生的抗体,结果显示这三种菌苗的抗体滴度明显高于rSC0016(pYA3493)组(P<0.01),表明重组疫苗株 rSC0016(pS-Eno)、rSC0016(pS-SaoA)、rSC0016(pS-6PGD)都可以引起良好的免疫应答。其中在首次免疫和加强免疫后,rSC0016(pS-Eno)和rSC0016(pS-SaoA)诱导的正对Eno和SaoA的IgG显著高于rSC0016(pS-6PGD)产生的针对6PGD的IgG(P<0.01);加强免疫后,rSC0016(pS-Eno)、rSC0016(pS-SaoA)rSC0016(pS-6PGD)在小鼠中诱导的IgA显著高于首免产生的IgA,但是三种蛋白抗原诱导的IgA没有显著差异;在加强免疫后7d,检测免疫小鼠肺脏和脾脏中的细胞因子IL-4和IFN-γ水平,结果是三种疫苗菌 rSC0016(pS-Eno)、rSC0016(pS-SaoA)和 rSC0016(pS-6PGD)诱导的 IL-4 和IFN-γ水平均明显高于空载体组(P<0.05)。其中,rSC0016(pS-SaoA)诱导的IL-4和IFN-γ水平均显著 rSC0016(pS-Eno)和 rSC0016(pS-6PGD)诱导的,而 rSC0016(pS-Eno)诱导的IL-4和IFN-γ水平也显著高于rSC0016(pS-6PGD)诱导的。动物保护性实验结果发现,经24×LD50剂量的SS2腹腔注射途径攻毒后,免疫rSC0016(pS-SaoA)和rSC0016(pS-Eno)组的小鼠的保护效率为100%,rSC0016(pYA3493)空载体组和空白对照组小鼠在24小时内全部死亡,而免疫rSC0016(pS-6PGD)组小鼠在7天内陆续死亡,保护效率为0。2携带猪圆环病毒2型Cap蛋白的减毒猪霍乱沙门菌疫苗的构建以及免疫效力评价Cap蛋白是猪圆环病毒2型ORF2基因编码的免疫保护性蛋白,能诱导机体产生中和抗体,因此cap基因是PCV2疫苗和诊断试剂的主要候选基因。本研究根据猪圆环病毒2型的ORF2的cap基因和去核定位信号的dcap基因的序列,设计扩增cap基因(702bp)和dcap基因(579bp)的引物,通过同源重组,成功构建pET28a-Cap、pET28a-dCap,转化入大肠杆菌 BL21 得到 BL21(pET28a-Cap)和 BL21(pET28a-dCap);经IPTG诱导、纯化获得蛋白Cap和dCap;用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔得到兔抗Cap和dCap的多抗血清;使用同源重组方法将cap基因和去核定位信号dcap基因插入asd+原核表达载体pYA3493,获得pS-Cap和pS-dCap质粒;将pS-Cap和pS-dCap质粒分别转化入重组减毒猪霍乱沙门菌载体rSC0016中,分别得到携带猪圆环病毒2型cap和dcap基因的重组减毒猪霍乱沙门菌株rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)。经Western-Blot检测证明rSC0016疫苗菌在多个部位能充分表达Cap和dCap蛋白。随后,本研究首先测定了 rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)在LB培养基中的生长能力;通过口服免疫的方式对这两株疫苗菌在小鼠体内的定植能力进行了评估;随后又以小鼠为模型评价了 rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)诱导的正对猪圆环病毒的Cap和dCap蛋白的免疫应答水平。生长曲线的结果显示,在培养后6h,rSC0016(pS-dCap)株的生长速率显著高于rSC0016(pS-Cap)株;定居实验显示,随着接种后时间的延长,rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)株在肝脏、脾脏和肠道派伊尔氏淋巴结上的细菌数量逐渐减少;接种后第14d,肝脾上分离不到疫苗株,但是在接种后第21d,肠道派伊尔氏淋巴结中的疫苗株数量仍在104CFU/g以上,并且rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)株的定居能力没有差异;间接ELISA检测免疫小鼠血清中抗Cap和dCap的IgG水平,结果显示rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)株在首次免疫和加强免疫诱导的针对Cap和dCap的IgG没有差异,并都显著高于空载体和空白对照组(p<0.01)。二免后2周,经腹腔注射途径,用106TCID50剂量的PCV2病毒攻毒,攻毒后14d,使用Real-timePCR的方法检测攻毒后免疫小鼠血清中的病毒含量,以评价rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)株的保护效率。结果显示,与空白对照组相比,rSC0016(pYA3493)的空载体组病毒含量与空白对照组相同,而免疫rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)组小鼠血清中病毒含量均显著减少(P<0.05)。表明所构建的rSC0016(pS-Cap)和rSC0016(pS-dCap)疫苗株对猪圆环病毒可以提供较好的保护效力。其中,免疫rSC0016(pS-dCap)株的小鼠血清中病毒拷贝数显著低于免疫rSC0016(pS-Cap)株的小鼠血清中病毒拷贝数,表明rSC0016(pS-dCap)株比rSC00 16(pS-Cap)株能提供更好的保护效力。本论文通过分子克隆技术,构建了重组减毒猪霍乱沙门菌rSC0016分别表达猪链球菌2型的烯醇化酶Eno蛋白、猪圆环病毒的Cap和dCap蛋白的二联疫苗候选株;使用Balb/C小鼠,分别评价了重组减毒猪霍乱沙门菌rSC0016递送猪链球菌2型的三种抗原6PGD、SaoA和Eno的免疫效率,以及重组减毒猪霍乱沙门菌rSC0016递送猪圆环病毒Cap和dCap蛋白的免疫效率;结果表明重组减毒猪霍乱沙门菌rSC0016递送猪链球菌2型的SaoA和Eno蛋白的保护效率显著高于6PGD蛋白;重组减毒猪霍乱沙门菌rSC0016递送猪圆环病毒Cap和dCap蛋白都能诱导出较好的免疫应答,并提供一定的保护效率。