研究背景骨肉瘤是儿童、青少年最常见的原发性骨恶性肿瘤,也是儿童和青少年癌症相关死亡的第二大原因,全世界每年的发病率为每百万人3、4例。骨肉瘤是高度恶性肿瘤,发展迅速,预后差,为患者和家庭带来巨大的痛苦。目前手术和化疗相结合是骨肉瘤治疗的常规方案。近年来骨肉瘤的诊断和治疗水平不断提高,但约60-70%的骨肉瘤患者没有从这些治疗中获益。局部骨肉瘤患者的5年生存率约为50%,而肺转移患者的5年生存率仅为15%。因此,开发新型有效的药物是提高骨肉瘤疗效的迫切需求。肿瘤干细胞(CSC)是恶性肿瘤组织中少量的具有肿瘤形成和自我更新能力的细胞。肿瘤干细胞与恶性肿瘤的发生、复发、耐药、侵袭和转移有关。因此,靶向骨肉瘤干细胞的药物将提高骨肉瘤的治疗效果。白藜芦醇(反式-3,4’,5三羟基二苯乙烯,白藜芦醇)是一种天然的小型多酚化合物,可从多种植物中提取,如桑椹、花生和葡萄。在过去十年中,已经在自然医学和营养学领域进行了深入的研究。研究表明白藜芦醇对多种肿瘤效果显著,例如白血病、前列腺癌和胃癌等。此外,白藜芦醇还能诱导胰腺癌肿瘤干细胞的凋亡。然而,白藜芦醇对人骨肉瘤干细胞的作用及其机制报道较少。STAT3信号通路在肿瘤细胞存活和疾病进展中显示出关键作用。在多种肿瘤细胞中观察到活化的STAT3,这可能是治疗骨肉瘤的靶点。最近的研究支持STAT3信号激活在CSCs存活中起关键作用。本研究将进一步分析人骨肉瘤干细胞中的STAT3通路,为优化骨肉瘤的治疗提供理论依据。第一部分白藜芦醇抑制骨肉瘤细胞生物学效应的研究目的:通过体内体外实验,研究白藜芦醇对骨肉瘤细胞生长的影响;通过体外实验,研究白藜芦醇对骨肉瘤细胞凋亡的影响。方法:1.对人成骨细胞系hFOB1.19和骨肉瘤细胞系MG-63和MNNG/HOS的细胞活力进行测定;不同浓度的白藜芦醇(0,10,20或40μM)处理细胞48小时后,进行CCK-8测定,使用酶标仪进行分光光度测量。2.通过克隆形成实验检测经白藜芦醇(20μM)处理的MG63和MNNG/HOS细胞的克隆形成能力。比较实验组和对照组的克隆形成率。3.白藜芦醇(40μM)处理骨肉瘤MG63和MNNG/HOS细胞48小时,用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒分析骨肉瘤细胞的凋亡。用FACS AriaⅡ流式细胞仪分析凋亡细胞的比例。4.白藜芦醇(40μM)处理骨肉瘤MG63和MNNG/HOS细胞48小时,检测骨肉瘤细胞内Caspase 3的活性,用Caspase 3活性试剂盒分析,通过pNA浓度来表示Caspase 3的活性。5.白藜芦醇(40μM)处理骨肉瘤MG63和MNNG/HOS细胞48小时,Western blot检测骨肉瘤细胞凋亡相关蛋白(Cleaved PARP和caspase3、Bax、Bcl-2和Bcl-xL)的表达情况。6.建立裸鼠皮下移植瘤模型。将裸鼠随机分成对照组和白藜芦醇组两组(每组n=5),每2天观察测量肿瘤体积。在植入第21天,处死小鼠并获得移植瘤用于最终观察。所有动物相关程序均经伦理委员会批准。结果1、白藜芦醇抑制骨肉瘤细胞的生长1.1 hFOB 1.19,MG-63和MNNG/HOS对白藜芦醇的IC50分别为1254μM、28.56μM和20.57μM。该实验表明白藜芦醇对骨肉瘤细胞具有选择性细胞毒性作用。1.2浓度为20或40μM白藜芦醇显著抑制骨肉瘤MG-63和MNNG/HOS细胞系的增殖(P<0.05),而对正常成骨细胞hFOB1.19则没有明显的抑制效果。1.3以40μM白藜芦醇作用于骨肉瘤细胞后,MG-63和MNNG/HOS细胞系的集落形成作用及增殖能力明显小于对照组(未给药组)(P<0.05),且表现为长期细胞生长抑制作用。1.4体内实验我们观察到:与对照组(未给药)相比,白藜芦醇给药组的移植瘤体积明显减小(P<0.05),说明白藜芦醇具有明显抑制肿瘤生长的作用。同时在实验期间,我们没有观察到动物出现明显的药物副作用。2.白藜芦醇诱导骨肉瘤细胞凋亡2.1流式细胞术检测发现:与照组相比,白藜芦醇处理显著增加MG63和MNNG/HOS细胞的早期和晚期凋亡百分比(分别为p<0.01)。2.2在白藜芦醇处理的MG63和MNNG/HOS细胞中观察到Caspase 3的活性增加(分别为p<0.01)。2.3 Western blot测量结果发现:白藜芦醇诱导骨肉瘤细胞中caspase3的裂解,促进Bax的上调,以及Bcl-2和Bcl-xL的下调。结论1.验证了白藜芦醇在体内、体外均抑制骨肉瘤细胞的生长。2.体外实验证明了白藜芦醇能够诱导骨肉瘤细胞的凋亡。第二部分白藜芦醇抑制骨肉瘤干细胞生物学效应的研究目的:通过体外实验,研究白藜芦醇对骨肉瘤干细胞的影响。方法:1.对CD133+MG-63和MNNG/HOS细胞进行细胞活力测定。不同浓度的白藜芦醇(0,10,20或40μM)处理骨肉瘤干细胞48小时后,进行CCK-8测定,使用酶标仪进行分光光度测量。2.肿瘤细胞成球实验是鉴定肿瘤干细胞的重要方法;将MG-63和MNNG/HOS细胞接种在超低粘附孔板中,用无血清干细胞培养基培养,加入不同浓度白藜芦醇(0,10,20或40μM)处理7天。计数直径>75um的肿瘤细胞球。通过二次成球实验,验证白藜芦醇持续的杀伤骨肉瘤干细胞的作用。3.将MG-63和MNNG/HOS细胞接种在超低粘附孔板中,用肿瘤干细胞培养基培养,加入白藜芦醇(40μM)处理7天。收集肿瘤细胞球,运用免疫荧光技术检测骨肉瘤细胞表面标志物CD133的表达。本实验使用激光共聚焦显微镜检查,使用ZEN软件进行图像分析。4.不同浓度的白藜芦醇(0,10,20或40μM)处理骨肉瘤细胞48小时后,通过流式细胞仪检测CD133+骨肉瘤细胞的比例。5.移植瘤标本进行IHC染色,检测经白藜芦醇处理后移植瘤中CD133的表达变化。结果1.实验证明,骨肉瘤细胞在7天内形成漂浮肿瘤球,白藜芦醇处理显著减少肿瘤球体积及数目(P<0.05)。进行二次成球实验,证实了白藜芦醇持续的杀伤骨肉瘤干细胞的作用(P<0.05)。2.免疫荧光染色显示,经白藜芦醇处理后骨肉瘤MG-63和MNNG/HOS中CD133表达显著低于对照组。3.用不同浓度的白藜芦醇处理骨肉瘤细胞48小时后,用流式细胞术分析CD133+细胞的百分比。结果表明:白藜芦醇降低了骨肉瘤细胞中CD133+亚群的比例(P<0.05)。4.FACS分选出CD133+骨肉瘤细胞,用不同浓度的白藜芦醇处理细胞48小时,细胞活力实验的数据表明白藜芦醇抑制骨肉瘤干细胞的增殖(P<0.05),并且这种抑制作用是剂量依赖性的。5.用MG-63皮下移植瘤标本进行IHC染色,显示白藜芦醇处理后降低移植瘤中CD133的表达。结论1.白藜芦醇减少了骨肉瘤中干细胞亚群的比例。2.白藜芦醇抑制了骨肉瘤干细胞的生长。第三部分白藜芦醇抑制骨肉瘤干细胞的机制研究目的研究白藜芦醇对骨肉瘤干细胞STAT3信号通路的影响。方法1.Western blot检测经白藜芦醇(40μM)处理后的骨肉瘤MG63和MNNG/HOS细胞中JAK2/STAT3信号通路相关蛋白(OncostatinM、p-STAT3、p-JAK2、STAT3和JAK2)的表达情况。2.Western blot检测经不同浓度白藜芦醇(0,10,20或40μM)处理后的骨肉瘤细胞的AKT/NF-kB信号通路相关蛋白(p-PI3K(Tyr199),p-AKT(Ser473)和NF-kB(p65))和CD133的表达情况。NF-kB通路是JAK2/STAT3通路的下游途径。3.为了进一步研究体内效应,用MG-63皮下成瘤标本进行IHC染色,显示白藜芦醇处理后移植瘤中p-STAT3的表达。4.用组成型活化的STAT3(STAT3-C)转染MG-63细胞,Western blot检测STAT3-C过表达MG63细胞经白藜芦醇处理后,CD133、STAT3、STAT3-Flag表达情况。5.对MG-63和MG-63/STAT3-C进行细胞活力测定;不同浓度的白藜芦醇(0,10,20或40μM)处理细胞48小时后,进行CCK-8测定,使用酶标仪进行分光光度测量。6.肿瘤细胞成球实验是鉴定肿瘤干细胞的重要方法;不同浓度白藜芦醇(0,10,20或40μM)处理的MG-63和MG-63/STAT3-C细胞在低粘附、无血清培养条件下培养7天,计数直径>75um的肿瘤细胞球。7.建立NOD/SCID鼠皮下移植瘤模型。将NOD/SCID鼠随机分成MG-63组和MG-63/STAT3-C组(每组n=5),每2天观察测量肿瘤体积。在植入21天,处死小鼠并获得移植瘤用于最终观察。所有动物相关程序均经伦理委员会批准。结果1.白藜芦醇抑制骨肉瘤细胞STAT3通路。1.1 Western blot测量结果发现:白藜芦醇(40μM)处理MG-63和MNNG/HOS细胞48小时后,观察到骨肉瘤中Oncostatin M,p-STAT3和p-JAK2表达降低。1.2 Western blot测量结果发现:不同浓度白藜芦醇(0,10,20或40μM)处理的MG-63和MNNG/HOS细胞中AKT/NF-kB信号通路相关蛋白p-PI3K,p-AKT和NF-kB表达显著降低,同时骨肉瘤干细胞标记物CD133的表达也降低。1.3用MG-63皮下移植瘤标本进行IHC染色,显示白藜芦醇处理后降低移植瘤中p-STAT3的表达。2.STAT3活化减弱了白藜芦醇对肿瘤干细胞的消除作用2.1用活化的STAT3(STAT3-C)转染MG-63细胞。Western印迹分析显示MG63/STAT3-C细胞中CD133的高表达。STAT3和CD133在STAT3-C活化的MG-63细胞中均表达,且与白藜芦醇是否给药无关。更重要的是,在STAT3-C活化的MG-63细胞中CD133的高表达并不能被白藜芦醇给药后逆转。2.2用不同浓度的白藜芦醇处理细胞48小时。白藜芦醇在20或40μM中显著抑制骨肉瘤MG-63增殖,而对MG-63/STAT3-C没有显著的细胞活力抑制效果;白藜芦醇明显的抑制骨肉瘤细胞的增殖,STAT3-C过表达显著消除了白藜芦醇对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用(P<0.05)。2.3实验证明,用低粘性悬浮培养系统建立悬浮的肿瘤球。骨肉瘤细胞在7天内形成漂浮球形集落,而白藜芦醇处理显著减少对照组肿瘤球体积及数量。更重要的是实验表明白藜芦醇不能减少STAT3-C过表达MG63细胞的肿瘤球数(P<0.05).2.4体内实验表明,白藜芦醇有效抑制对照移植瘤的生长,但不抑制STAT3-C过表达肿瘤的生长(P<0.05)。结论1.白藜芦醇通过抑制STAT3信号通路对骨肉瘤干细胞进行杀伤作用。2.STAT3的活化减弱了白藜芦醇对肿瘤干细胞的杀伤作用。