长链非编码RNA(long noncoding RNA,LncRNA),作为近年来分子水平的研究热点,在肿瘤生物学领域研究比较新,处于初级阶段,与肿瘤关系的研究还处于起步阶段。其LncRNA在肿瘤中的作用模式、调控机制,以及对肿瘤发生、发展的调控作用还研究的不够透彻。但是LncRNA在癌症的发生和发展过程中的重要作用已经得到证实,因为LncRNA不仅可以作为原癌基因促进癌细胞的增殖和转移,还可以作为抑癌基因对癌症的发生发展起到一定的抑制作用。LncRNA在癌症方面的研究已经得到了证实,发现在多种肿瘤中都检测到IncRNAs表达出现异常。为此,本研究将通过LncRNA HNF1A-AS1和LncRNA BX357664研究LncRNA与结直肠癌之间的关系,为后续结直肠癌的治疗提供一定的依据。本研究根据LncRNA的不同分为两个部分的内容:(1)LncRNA HNF1A-AS1促进结直肠癌细胞增殖和迁移及其机制研究;(2)LncRNA BX357664抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移,促进凋亡的功能研究。第一部分目的:本研究拟对结直肠癌组织和细胞进行LncRNA HNF1A-AS1表达检测,并通过敲低或过表达HNF1A-AS1等手段对结直肠癌细胞的增殖迁移等生物学功能和作用机制进行研究。方法:(1)选取结直肠癌细胞系:收集2015.6-2017.6期间于我院进行结直肠癌手术切除的32例患者的结直肠癌组织及其癌旁组织;培养结直肠癌细胞HCT116、HT29、SW480和SW620并进行裸鼠成瘤实验;对人的结直肠癌组织、细胞及裸鼠成瘤进行HNF1A-AS1 mRNA检测,选取两株结直肠癌细胞系进行后续实验;(2)敲低HNF1A-AS1的效果观察及功能研究:(体外检测)敲低SW480和SW620细胞中HNF1A-AS1,将细胞分成Si-NC组、Si-HNF1A-AS1组,对其敲低效果进行RT-PCR检测;并使用Ki67染色、MTT检测三组细胞的增殖程度;划痕实验和Transwell法检测三组细胞的迁移能力;Annexin V/FITC检测细胞凋亡;(3)过表达HNF1A-AS1的效果观察及功能研究:(体外检测)构建过表达HNF1A-AS1的重组质粒,并转染SW620细胞和SW480细胞,将细胞分为质粒空载组和HNF1A-AS1过表达组,对其过表达效果进行GFP流式检测及RT-PCR检测。并使用Ki67染色、MTT法检测三组细胞的增殖情况;划痕实验和Transwell法检测两组细胞的迁移能力;(4)体内验证HNF1A-AS1对肿瘤的作用:(体内检测)用慢病毒转染的方式构建HNF1A-AS1敲低的稳定株。首先用包装好的带有HNF1A-AS1干扰片段的慢病毒转染SW480和SW620细胞,之后用G418筛选,得到稳定株。同时用过表达质粒转染、G418筛选、流式分选等方式构建过表达HNF1A-AS1的稳定株。之后将空白对照组、Si-NC组、Si-HNF1A-AS1组、pEGFP-C1空载组、过表达Si-HNF1A-AS1组的细胞植入裸鼠皮下组织,确定其体内成瘤情况及肿瘤体积大小,观察HNF1A-AS1在体内的作用;(5)HNF1A-AS1促进EMT的机制研究:荧光素酶报告基因确定LncRNA HNFIA-ASl与PIGR的靶向关系。利用RT-PCR、Western blot等手段检测结直肠癌细胞及裸鼠成瘤组织中PIGR、E-Cadherin、Vimentin的表达情况。之后通过HNF1A-AS1敲低或过表达的稳定株确定PIGR和上皮间质转化之间的关系。结果:(1)32例病人结直肠癌组织、结直肠癌细胞系及裸鼠成瘤中HNF1A-AS1表达上调,且SW480细胞和SW620细胞中,HNF1A-AS1的相对表达量在四种结直肠癌细胞系中处于最低和最高,同时四种结直肠癌细胞系裸鼠成瘤的增殖情况不具有统计学差异(P>0.05),所以选取SW480和SW620细胞进行后续实验;(2)SiRNA 干扰敲低 SW480 和 SW620 细胞中的 HNF1A-AS1 后,RT-PCR检测敲低效率,Si-HNF1A-AS1与Si-NC组相比,HNF1A-AS1的mRNA表达水平降低具有统计学差异(P<0.05),说明SW480和SW620细胞中HNF1A-AS1敲低成功。同时,空白对照组和Si-NC组在细胞增殖、迁移和凋亡上不具有统计学意义上的差异,(P>0.05)。与空白对照组和Si-NC组相比,Si-HNF1A-AS1细胞增殖能力减弱,迁移能力降低,以及凋亡增加;(3)构建过表达HNF1A-AS1的重组质粒HNF1A-AS1-pEGFP-C1,转染SW480和SW60细胞,GFP分析和RT-PCR检测HNF1A-AS1的表达效率。质粒转染效率高达70-80%,空白对照组和pEGFP-C1空载组的HNF1A-AS1的mRNA表达水平不具有统计学差异(P>0.05),但过表达质粒组HNF1A-AS1-pEGFP-C1与空白对照组和pEGFP-C1空载组相比,HNF1A-AS1的表达水平增高具有统计学差异(P<0.05),说明过表达HNF1A-AS1的重组质粒构建成功。同时,空白对照组和pEGFP-C1空载组在细胞增殖、迁移上不具有统计学意义上的差异,(P>0.05)。与空白对照组和pEGFP-C1空载组相比,过表达质粒组HNF1A-AS1-pEGFP-C1增殖、迁移能力增强;(4)用带有HNF1A-AS1干扰片段的慢病毒去感染SW480和SW620细胞,G418筛选得到稳定株。过表达HNF1A-AS1的重组质粒构建成功后,转染SW480和SW620细胞,G418筛选后用流式分选,得到稳转株。之后裸鼠成瘤,空白组、Si-NC组、pEGFP-C1空载组肿瘤大小相当,但是Si-HNF1A-AS1组肿瘤明显小于空白组和Si-NC组,而过表达HNF1A-AS1组肿瘤体积明显变大。每周肿瘤体积检测结果显示五组细胞成瘤能力在前四周不具有统计学意义上的差异,但是随着细胞注射时间的延长,Si-HNF1A-AS1组、过表达组与空白组和Si-NC组表现出明显的差异(P<0.05);(5)荧光素酶报告基因检测结果显示Si-NC组中,SW620细胞敲低HNF1A-AS1且没有敲低结合位点的PIGR 3’UTR-WT组的荧光酶活性明显高于WT组(P<0.05),敲低HNF1A-AS1并敲低结合位点的PIGR 3’UTR-MUT转染组与野生型的荧光素酶活性不存在明显改变,P>0.05,说明PIGR是HNF1A-AS1的靶基因。Western blot检测PIGR、E-cadherin、Vimentin蛋白结果显示空白组与Si-NC组、pEGFP-C1空载组之间蛋白的灰度值相当。HNF1A-AS1敲低组细胞的PIGR和Vimentin降低,E-cadherin增加。HNF1A-AS1过表达组的PIGR和Vimentin增加,E-cadherin降低。RT-PCR检测结果相符,且差异具有统计学意义;结论:(1)LncRNA HNF1A-AS1在病人结直肠癌组织和结直肠癌细胞系、裸鼠成瘤组织中的表达增加;(2)在体外条件下,利用SiRNA干扰技术和重组质粒转染技术成功敲低或增加了 HNF1A-AS1的表达水平;验证了 HNF1A-AS1在结直肠癌细胞中的生物学功能:促进增殖和迁移,抑制凋亡;(3)成功构建敲低及过表达HNF1A-AS1的稳定株,裸鼠皮下成瘤,体内验证了 HNF1A-AS1对肿瘤的作用;3(4)机制研究:通过敲低及过表达HNF1A-AS1 的稳定株,验证了HNF1A-AS1可通过PIGR促进结直肠癌的上皮间质转化。第二部分目的:第一部分研究LncRNA HNF1A-AS1的功能是促进增殖、迁移,抑制凋亡;为此,将通过研究另一种LncRNA BX357664对结直肠癌的生物学调控作用,阐述LncRNA对肿瘤的作用。本研究拟对结直肠癌组织和细胞进行LncRNA BX357664表达检测,并通过构建过表达BX357664质粒等手段研究BX357664对结直肠癌细胞增殖、迁移、凋亡、周期及EMT调控等方面进行研究。方法:(1)收集进行结直肠癌手术切除患者的结直肠癌组织及其癌旁组织;培养结直肠癌细胞COLO205、HT29、HCT1 16及人的肠上皮细胞HIEC-6(对照);进行BX357664 mRNA检测,选取两株结直肠癌细胞系进行后续实验;(2)构建过表达BX35764的重组质粒,并转染HCT116细胞和HT29细胞,将细胞分为空白对照组、质粒空载组和BX357664过表达组,对其过表达效果进行RT-PCR检测。并使用克隆形成实验、MTT法、细胞周期实验检测三组细胞的增殖情况;划痕实验、迁移实验和侵袭实验检测三组细胞的迁移能力;Western blot检测细胞周期相关蛋白和EMT相关蛋白的表达情况;细胞凋亡检测试剂盒检测三组细胞的凋亡情况。结果:(1)病人结直肠癌组织、结直肠癌细胞系中LncRNA BX357664 mRNA表达水平下调,选取HCT116和HT29细胞进行后续实验;(2)成功构建过表达BX357664的重组质粒,转染HCT116细胞和HT29细胞后,BX357664的mRNA表达水平增加。克隆形成实验、MTT法、细胞周期实验显示空白对照组和质粒空载组之间不具有统计学差异(P>0.05),但与空白对照组和质粒空载组相比,过表达BX357664质粒组克隆形成能力减弱、细胞生长减缓、周期受到阻滞,这些差异具有统计学意义(P<0.05)。同时,细胞划痕实验、迁移实验和侵袭实验结果表明,与空白对照和质粒空载相比,过表达BX357664质粒组迁移能力、侵袭能力、损伤修复能力减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot显示过表达BX357664质粒组细胞周期相关蛋白Cyclin B1、CDC25C、Cyclin D1 表达下降,同时上皮 marker E-Cadherin 增加,间质 marker N-Cadherin下降,差距具有统计学意义(P<0.05)。同时,细胞凋亡检测试剂盒显示过表达BX357664质粒增加了 Caspase3、Caspase9的表达,但Caspase8的表达无明显差异,说明过表达BX357664通过外源性途径促进了结直肠癌细胞的凋亡。结论:(1)病人结直肠癌组织和结直肠癌细胞系COLO205、HCT116、HT29中BX357664的mRNA表达水平下调;(2)成功构建过表达BX357664的重组质粒,BX357664抑制了结直肠癌细胞的增殖和迁移及EMT,促进了结直肠癌细胞的凋亡。本研究分为两部分的内容,LncRNA HNF1A-AS1促进结直肠癌细胞的增殖和迁移、抑制凋亡。LncRNA BX357664抑制了结直肠癌细胞的增殖和迁移、促进凋亡。并对其EMT机制进行了一定的阐述。两种不同的Lnc RNA对于结直肠癌细胞起到了相反的作用,跟前人对于LncRNA的研究结果一致,即LncRNA具有双向性,即可促进又可抑制结直肠癌细胞的发生发展。研究两种不同的LncRNA,可以更进一步阐述LncRNA在肿瘤中的作用,同时为临床上治疗结直肠癌癌症提供新的靶点和新的治疗思路,更好的为临床治疗提供依据以及医疗参考。