南美白对虾因其味道鲜美、营养丰富,一直深受中国及其亚洲其他地区消费者的青睐。然而,也正因为其丰富的营养成分,成为微生物聚集和居住的最佳场所。其中,副溶血性弧菌和沙门氏菌是南美白对虾中最为常见的两种食源性致病菌,成为食物中毒事件的重要威胁因子。此外,由微生物活动引起的食品腐败变质问题,也对食品品质安全和人生财产安全提出了严重挑战,阻碍了相关产业发展,给国民经济造成了一定程度的负面影响。为了解决这些潜在威胁,建立有效的微生物监测技术一直成为食品行业关注的焦点问题。叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)是一种对核酸具有高度亲和力的光敏反应染料,能够进入具有不完整细胞壁或细胞膜的细菌死细胞中,选择性地交联死菌DNA。将其与DNA扩增检测技术相结合,可有效地抑制死菌细胞DNA的扩增,从而实现活菌检测。因此,本文旨在(1)构建一种活菌定量检测技术用于生鲜南美白对虾中沙门氏菌的快速检测;(2)构建一种高通量活菌定量技术用于同时定量检测生鲜南美白对虾中活的副溶血性弧菌和沙门氏菌并建立两种高效冷杀菌技术(超高压和酸性电解水)失活模型;(3)构建一种活菌前处理结合高通量测序技术用于描述采收后南美白对虾在贮藏期间真实存在的微生物多样性变化。本课题主要研究内容和研究结果如下:1.PMA应用于生鲜南美白对虾中沙门氏菌活菌定量检测方法的构建本研究构建了一种PMA结合荧光定量PCR方法,以快速定量检测生鲜南美白对虾中沙门氏菌活菌。通过源于23种60株的受试菌株的验证试验,证明该方法具有较高的特异性。经PMA浓度优化实验,确定100μM为最佳PMA使用浓度,与荧光定量PCR技术相结合,可有效抑制106 CFU/m L沙门氏菌死菌DNA的扩增,与先前研究相比,可显著提高沙门氏菌死菌抑制性。此外,沙门氏菌在纯培养和人工接种虾样中的最低检测限分别为36 CFU/g和100CFU/g。最后,运用PMA-q PCR、q PCR及传统涂布法对含不同死活菌比例生虾样品的检测结果进行验证,结果显示该方法与传统涂布方法的结果没有显著性差异,而显著优于荧光定量PCR检测结果。总之,本研究构建的PMA结合荧光定量PCR技术可为水产品中沙门氏菌的活菌定量提供一个有效的检测工具。2.PMA应用于生鲜南美白对虾中副溶血性弧菌及沙门氏菌活菌定量方法的构建本研究构建了一种PMA前处理结合多重荧光定量PCR活菌检测方法,用于同时定量检测生鲜南美白对虾中活的副溶血性弧菌和沙门氏菌。通过PMA前处理优化试验,确定100μM PMA浓度和15 min暗处理时间为PMA最优的前处理条件,与多重荧光定量PCR技术相结合,可有效抑制106 CFU/m L副溶血性弧菌和沙门氏菌死菌DNA的扩增。经68株受试菌株的验证试验,证明该方法具有较高的特异性。通过建立这两种菌在纯培养和人工接种虾样中的标准曲线,确定该方法具有良好的扩增效率,并获得较低的检测限。此外,该方法应用于构建超高压及酸性电解水技术杀菌失活模型的结果显示,PMA结合多重q PCR的致死率(D10)与传统平板计数结果一致,且显著优于多重q PCR结果。总之,本研究构建的新型多重活菌定量技术快速有效,可为水产品中常见食源性致病菌的检测及冷杀菌技术杀菌效果的评价提供一种有效的工具,从而保障水产品质量和改善公共卫生。3.基于PMA前处理技术结合高通量测序分析采收后南美白对虾贮藏过程中微生物多样性的变化本研究分析了采收后南美白对虾在不同温度下(4、7、15、30oC)自然存在的微生物多样性变化。基于PMA前处理技术,去除菌体中的死菌,提取获得菌体中活菌基因组,再经第二代高通量测序技术(Illumina Hi Seq2000/2500/4000)对基因组进行16s r DNA测序,并根据分析要求绘制成多样本群落组成柱状图、PCA图、热图、Venn图等。结果显示,样品经过PMA前处理与未经过PMA前处理在微生物群落结构上存在明显差异,主要表现在微生物种类以及物种丰度上的差异。此外,温度越高这种差异越小,表明PMA对低温条件下微生物菌群多样性分析有较好的修正作用。为了探究食品腐败的原因,本研究分析比较各个样本主要微生物物种类别以及丰度,结果显示Exiguobacterium(微杆菌属)、Vibrio(弧菌属)、Lactococcus(乳酸菌属)、Aeromonas(气单胞菌属)、Shewanella(希瓦氏菌属)、Kurthia(库特氏菌属)、Enterococcus(肠球菌属)等是所有样本的共同优势菌。本研究所运用的PMA前处理结合高通量测序不仅能为食品冷链物流提供良好的技术支持,还为研究南美白对虾在贮藏期间发生腐败变质机理的研究提供有效的数据基础。我们相信,本课题的研究能够推动基于PMA前处理的活菌定量检测、水产品贮藏期间群落结构变化等其相关研究的发展,为活菌领域的研究提供一定的数据基础。