现代医学个性化医疗的发展趋势对药物分析学科发展提出新的研究方向,已不再局限于药物成品的化学检验、药物生产过程的质量控制及药物贮存过程的质量考察等方面,更加关注根据不同患者个体状态,提供精确的药物治疗方案。其中原发性耐药问题是用药选择中的重要依据,即不同患者间对药物治疗反应差异很大,一部分患者会对药物无受益反应,这种现象在抗肿瘤药物方面尤为突出。肝细胞癌（HCC）是全球第六大常见癌症,也是全球癌症相关死亡率的第二大病因。这种致命疾病的发病率正在逐年上升。目前,临床上包括切除、肝移植或消融在内的治疗方法,仅在早期HCC患者中可行。对于晚期HCC患者,仍然缺乏最佳治疗方案。索拉非尼是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的第一种用于晚期HCC的一线药物,尽管索拉非尼能有效延长晚期HCC患者中位生存时间,但是在临床药物治疗过程中,发现许多患者对索拉非尼产生原发性耐药或获得性耐药反应,严重影响HCC的治疗效果。原发性耐药是指患者在用药初始时,就对药物的治疗无受益反应,药物无法抑制肿瘤的增长,导致肿瘤病灶体积增大或者发生远端转移。获得性耐药是指患者随着用药时长的增加,对药物敏感度逐渐降低,其耐药机制已经研究得较为清晰,包括PI3K-Akt和JAK-STAT途径之间的串扰、缺氧的肿瘤微环境等。由于索拉非尼原发性耐药机制尚未阐明,晚期HCC患者不能及时获得精准的临床用药指导,导致错过最佳治疗时机,这也是HCC相关临床药学精准医疗的重大挑战之一。索拉非尼原发性耐药机制研究困难主要有两个原因:（1）晚期HCC患者的肿瘤组织样本难以获得:到目前为止,HCC索拉非尼原发性耐药并没有循证医学能够作为临床用药参考的肿瘤标志物。需要服用索拉非尼进行治疗的患者都处于HCC晚期,即出现远端转移。此时想要获得肿瘤组织样本,还需再次通过肝穿刺进行取样,患者依从性较差,手术切除又不符合医学伦理学的要求,因此难以获得患者肿瘤组织样本进行原发性耐药的研究。（2）缺少针对HCC复杂组织样本空间异质性的研究手段:索拉非尼原发性耐药的研究需要大量HCC细胞生物信息数据作为研究基础,HCC组织不仅包括恶性细胞和转化细胞,还包括从周围组织和免疫系统募集的大量不同类型细胞。使用传统的批量测序技术只能对这种高度复杂的组织进行平均定性表征,忽略了肿瘤样本中单个细胞的独特表型和功能特征,导致测序分析结果与真实肿瘤细胞特征有很大差距。为解决索拉非尼原发性耐药机制的研究难点,本论文在第二章中,使用未经索拉非尼治疗过的HCC患者的肿瘤组织,构建了多组人源肿瘤异种移植（PDX）模型作为实验肿瘤组织样本来源。相较于传统的细胞系移植模型,PDX模型的肿瘤组织未经过体外培养,保持了原发肿瘤的遗传特性和异质性,实验结果临床预见性更好,能够使晚期HCC患者肿瘤组织样本难以获得的问题得到解决。通过索拉非尼药效学筛选,鉴定出索拉非尼原发性耐药组和索拉非尼敏感组的PDX模型。在第三章中,采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术对成分复杂的PDX肿瘤组织样本进行更精细的测序及表征。ScRNA-seq可以在单个细胞水平上,对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析。将索拉非尼原发性耐药组和敏感组的scRNA-seq数据进行分析比较,通过单细胞数据推断基因调控网络和细胞功能聚类（SCENIC）鉴定出了特殊的细胞亚群,这个细胞亚群属于索拉非尼原发性耐药的PDX模型。SCENIC分析显示这类细胞中JUN,JUND和FOS（HIF主要调控基因）被异常激活。接下来又进行了基因表达定量集分析（QuSAGE）,结果表明这个特殊亚群中的细胞无氧代谢相关信号通路被上调。在第四章中,通过细胞间通讯数据分析,发现这个细胞亚群通过新生儿Fc受体（FcRn）和白蛋白（ALB）与固定的几个细胞亚群进行了高强度的相互作用,并且这个特殊亚群内的细胞之间也依靠ALB-FcRn进行高强度相互作用,这种现象并未出现在其他的细胞亚群。因此推断这个细胞亚群是产生索拉非尼原发性耐药的主要细胞亚群,这类细胞在索拉非尼的压力下,通过ALB-FcRn相互作用,使细胞内的缺氧诱导因子（HIF）相关信号通路转录因子被高度激活,细胞进入乏氧代谢,并产生了索拉非尼抗性。为了验证ALB-FcRn互作在索拉非尼原发性耐药中的作用,将索拉非尼Huh7耐药细胞株和Huh7野生型细胞株饥饿处理后,用牛血清白蛋白（BSA）刺激,随后进行转录组测序。测序结果分析后发现,耐药细胞株在BSA刺激后,多条与中心法则相关的信号通路被上调,而野生型细胞株被上调的多为离子通道相关信号通路。在药效学实验中,将Huh7细胞株的FcRn进行敲除,与Huh7野生型细胞株相比,敲除FcRn后的Huh7细胞株拮抗索拉非尼的能力明显变弱,这表明了FcRn与索拉非尼原发性耐药的相关性。综上所述,本论文在单细胞水平上研究了索拉非尼原发性耐药组和敏感组PDX模型肿瘤组织中的细胞转录组差异。实验结果表明,在发生原发性耐药的细胞亚群中,转录因子JUN能够调控HIF信号通路形成乏氧的肿瘤微环境以拮抗索拉非尼;ALB及其受体FcRn是该细胞亚群与其他细胞亚群发生相互作用的核心途径,该细胞亚群能够通过ALB与FcRn相互作用,刺激自身和其他细胞亚群向拮抗索拉非尼的方向分化。本论文的研究结果在细胞群层面初步揭示了索拉非尼发生原发性耐药的分子机制,为非索拉非尼受益的HCC适应症药物开发和临床用药前筛查提供了一定的理论基础及可借鉴的研究方法。