蓝色犁头霉中甾体11β-羟化酶的分离纯化及其酶学性质的简单研究

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通过在菌体生长适当阶段添加诱导物黄体酮,对细胞内P450含量的跟踪检测来考察11β-羟化酶的诱导情况,发现加入黄体酮诱导4h后,菌体内P450含量上升到原来的3倍左右,并通过考察原生质体以及胞内微粒体部分的转化情况来对此酶系在菌体内的位置进行初步定位。 通过在破菌液中变化辅酶,温度,pH值,金属离子等因素,对蓝色犁头霉中11β-羟化酶的酶学性质进行初步研究。蓝色犁头霉细胞内11β-羟化酶系统最适催化温度在30℃左右,pH值在7.0左右。利用NADPH作为辅酶,不利用NADH。在1mM条件下,Ca2+和Fe2+可显著提高11β-羟化酶的催化活性,而Mg2+,Mn2+,Cu2+和Zn2+,却显著抑制11β-羟化酶的催化活性。 经过四步柱层析和一步TritonX-100增溶膜蛋白,优化层析条件,得到目标P450蛋白。电泳显示分子量在60kDa左右,与CO反应在448nm处有特征峰。与底物结合,吸收峰发生偏移,在389nm和368nm处出现吸收峰,在416nm处出现最小值。
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