论文部分内容阅读
目的:1.研究APC/CCDC20介导泛素蛋白酶途径在高龄卵子老化过程中的调控作用及其分子机制;2.研究补肾法对APC/CCDC20介导泛素蛋白酶途径的影响,探讨补肾法改善高龄卵母细胞质量的分子机理。方法:1.收集IVF/ICSI治疗中年轻组(≤30岁)与高龄组(≥37岁)的临床资料,进行回顾性分析,比较两组患者的卵子和胚胎发育情况;同时收集临床MII期卵母细胞进行单细胞RNA-Seq测序,分析高龄卵子老化的转录组学信息;收集临床废弃GV、MI及MII期卵母细胞,利用Q-PCR及免疫荧光染色技术对单细胞RNA-Seq结果进行验证。2.收集年轻组(8-10周龄)及高龄组(36-40周龄)昆明小鼠GV、MI与MII期卵母细胞,通过Q-PCR及免疫荧光染色技术,检测APC/CCDC20介导泛素蛋白酶途径关键基因的表达情况,并比较异常纺锤体比率;利用IVM培养体系(对照组和TAME组),观察年轻小鼠GV期卵母细胞生长发育情况及纺锤体形态,检测APC/CCDC20介导的泛素蛋白酶途径关键基因的表达。3.回顾性分析IVF/ICSI治疗中高龄组(≥37岁)与补肾组(≥37岁)的临床资料,比较卵子、胚胎发育情况及妊娠结局,评价补肾法在IVF/ICSI高龄助孕中的临床疗效。4.比较年轻组、高龄组及补肾组小鼠动情周期变化、性激素、卵巢指数以及产仔数,观察卵巢组织形态学及卵母细胞形态学变化;并收集小鼠各期卵母细胞,免疫荧光染色检测APC/CCDC20介导泛素蛋白酶途径关键基因变化情况,观察纺锤体形态;获取年轻组、高龄组和补肾组小鼠GV期卵母细胞,通过IVM培养中加/不加TAME,观察各组小鼠卵母细胞生长发育和纺锤体形态;获取高龄组小鼠GV期卵母细胞,按是否加大鼠血清和/或抑制剂干预,观察各组小鼠卵母细胞的生长发育。结果:1.IVF/ICSI治疗中高龄组患者的获卵数、成熟卵数、受精数、卵裂数、有效胚胎数、优质胚胎数以及卵子成熟率均低于年轻组患者(P<0.05),其中45岁及以上患者差异更加显著(P<0.05);我们从RNA-seq数据119个显著性差异基因中,筛选出CDC26和ESPL1,发现它们在卵母细胞减数分裂中发挥重要作用;Q-PCR及免疫荧光染色显示:高龄组MII期卵母细胞CDC26呈现低表达,而ESPL1则表现高表达(P<0.05),这与单细胞RNA-seq数据分析一致;免疫荧光染色显示:高龄组GV期及MI期卵母细胞CDC26和ESPL1均呈现低表达(P<0.05);同时,免疫荧光染色也表明:高龄组GV、MI及MII期卵母细胞CDC20均表达明显降低(P<0.05)。2.Q-PCR和免疫荧光染色显示:年轻组小鼠中CDC20,CDC26,Securin,ESPL1及REC8均在MI期表达达到高峰(P<0.05);Q-PCR及免疫荧光染色数据表明:在GV期,高龄组小鼠卵母细胞中CDC20,CDC26,Securin,ESPL1及REC8的表达水平均显著低于年轻组(P<0.05);在MI期,高龄组小鼠卵母细胞中CDC20,CDC26及ESPL1的表达水平均显著低于年轻组(P<0.05),而Securin和REC8的表达水平却明显升高(P<0.05);在MII期,除ESPL1外,CDC20,CDC26,Securin及REC8 4个基因在高龄卵母细胞中的表达显著降低(P<0.05);同时,我们观察到高龄组小鼠卵母细胞的异常纺锤体比率(55.56±10.64)显著高于年轻组(11.44±9.92)(P<0.05);IVM体系中加入200μM TAME能够显著降低年轻组小鼠卵母细胞成熟率(44.85±6.90)(P<0.05),同时CDC20,CDC26及ESPL1的表达水平也显著减低(P<0.05),而Securin和REC8的表达量却呈现升高趋势(P<0.05),并且纺锤体的异常比例(52.23±8.68)显著高于对照组(29.17±8.78)(P<0.05)。3.补肾组患者的获卵数、成熟卵数、受精数、卵裂数、有效胚胎数以及优质胚胎数均显著高于高龄组患者(P<0.05);尤其在40-44岁年龄段中,补肾组患者以上各项指标均显著高于高龄组(P<0.05)。4.补肾调经方帮助高龄小鼠建立较为规律的动情周期,提高了卵巢指数和雌激素水平,降低了FSH水平,同时增加了窦前卵泡及窦卵泡数量以及GV期、MII期获卵数,最终提高了产仔数(P<0.05);补肾调经方能够提高高龄小鼠GV期卵母细胞CDC20和CDC26的表达(P<0.05),并且降低MII期ESPL1的表达和纺锤体的异常比率(P<0.05);补肾组的IVM成熟卵率(66.66±9.90)明显高于高龄组(51.54±6.39)(P<0.05),补肾+TAME组的IVM成熟卵率(44.65±7.70)也高于高龄+TAME组(30.01±17.02);补肾组的IVM异常纺锤体比率(50.17±3.60)明显低于高龄组(62.04±12.53)(P<0.05),补肾+TAME组的异常纺锤体比率(61.35±1.26)也低于高龄+TAME组(76.11±3.47);最后与高龄组相比(58.33±2.89),补肾血清组的卵母细胞成熟率(67.67±5.51)明显提高(P<0.05),而补肾血清+TAME组的成熟率(56.67±4.16)也高于高龄+TAME组(43.00±6.08)(P<0.05)。结论:1.与年龄相关的卵母细胞老化表现为卵子数量和质量的降低,尤其是卵子成熟率的降低,不建议45岁及以上高龄女性选择ART助孕。2.APC/CCDC20介导的泛素蛋白酶途径功能紊乱(或在启动时间上发生错误,或在启动能力上造成损失)致使减数分裂异常,是高龄卵子老化发生的重要机制。3.补肾法可以辅助IVF/ICSI治疗改善高龄女性生殖能力。4.补肾调经方可以通过APC/CCDC20介导的泛素蛋白酶途径一定程度上改善高龄小鼠老化卵母细胞质量。