水稻几丁质酶基因的转录与表达特征研究

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背景:几丁质是由N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine, NAG)以β-1,4糖苷键连接聚合而成。研究发现几丁质,尤其是寡聚几丁质可以先作为信号来激发植物的防卫反应,即病原物相关分子模式(microbe/pathogen associated molecular pattern, MAMP)。几丁质酶(Chitinase, CHIT)可将几丁质分解为寡聚几丁质或NAG,其在植物生理、生化过程、抗逆、防御反应中都扮演了重要的角色。水稻是人类主要的粮食作物之一,白叶枯病是水稻最为严重的细菌性病害之一,因此了解几丁质酶在水稻不同样本中的转录与表达特征具有一定的基础意义。已有研究表明,调控一些水稻几丁质酶的表达变化会引起水稻对病原菌防御反应的变化。这暗示了水稻几丁质酶在水稻病原物互作中的重要作用。研究目的:制备水稻几丁质酶蛋白质抗体,整合水稻几丁质酶基因在水稻生长发育过程和与Xoo互作过程中的转录信息,并检测了两个过程中的几丁质酶蛋白质表达模式,为深入了解水稻几丁质酶蛋白质基因功能提供基础。材料与方法:水稻品种93-11,4021,白叶枯病菌PXO99野生型,对白叶枯病菌突变株PXO99ΔraxST,菌液剪切叶片进行接种,以灭菌蒸馏水作为对照。接种后各时间点采集接种部位叶片提取蛋白之后作为样品进行免疫印迹(Western Blotting,WB)检测。多克隆抗体的制备由北京华大蛋白质研发中心有限公司完成。用ImageJ软件扫描χ光片上的条带信号,进行分析。根据几丁质酶蛋白质的Locus号,获得几丁质酶基因编码的蛋白质序列,多序列比对使用ClustalW,系统树分析使用Mega4.0,结构域分析使用SMART软件进行。从水稻基因组注释项目(Rice genome annotationproject)数据库下载RNA-Seq产生的FPKM (Reads per kilobase of exon model permillion mapped reads)数据,进行分析。结果:利用WB检测10个Chit基因编码蛋白质的叶片表达谱,发现CHIT5的表达量在水稻叶片生长过程中下调,而CHIT6、CHIT14、CHITC1和CHITC2的表达量上调。在水稻与白叶枯病菌(Xoo)的不亲和反应中,CHIT1、CHIT2、CHIT5、CHIT6、CHIT10、CHIT15和CHIT16的表达量上调,CHIT14、CHITC1和CHITC2的表达表现下调。进一步比较几丁质酶蛋白质在水稻-Xoo不同互作反应中的表达,发现其在亲和及不亲和反应中的表达模式类似,但一般在亲和反应中强度变化较大。此外,CHIT6蛋白质在对照反应中的表达量发生上调。结论:检测水稻几丁质酶蛋白质表达,仅发现有5个几丁质酶蛋白质在正常叶片中有表达,而在水稻与Xoo不亲和反应中,有10个几丁质酶蛋白质的表达发生了变化,其中CHIT1、CHIT2、CHIT5、CHIT10、CHIT15和CHIT16的表达都是受诱导后发生的,多个几丁质酶的表达受白叶枯病菌接种的诱导,提示它们在抗病反应中可能发挥作用。有3个几丁质酶蛋白质的表达在接种白叶枯病菌后下调,它们是CHIT14、CHITC1和CHITC2,提示它们可能发挥负调控的作用,CHIT6在对照(Mock)反应中表达上调,可能是受创伤诱导的基因,暗示了其表达与创伤的关联性。
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