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卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是中国和亚太地区重要的海水养殖物种之一,具有生长速度快,经济价值高,适合网箱养殖等优点。随着养殖业的发展,抗生素的用量也逐渐增大,不仅污染环境,还会导致病原体产生抗药性。抗菌肽抑菌机理与抗生素不同,不易产生抗药性,是抗生素的潜在替代物,筛选相关的抗菌肽基因可以用于培育优良品种。为了研究卵形鲳鲹抗菌肽基因功能及调控机制,本研究扩增了LEAP-2和NK-lysin基因cDNA全长序列,通过生物信息学分析了基因的结构特征,用其编码的氨基酸序列与其他物种进行多重比对,构建进化树。经美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)刺激卵形鲳鲹后,利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)分析LEAP-2和NK-lysin基因的组织差异表达及组织分布。克隆了基因的成熟肽片段,构建原核表达载体,并成功在体外表达。扩增了LEAP-2和NK-lysin基因启动子序列,通过构建荧光素酶报告基因重组质粒检测活性,筛选核心启动子。利用PCR介导的定点突变技术,构建转录因子结合位点突变体,通过构建荧光素酶报告基因重组质粒检测活性,筛选出主要转录因子。具体研究成果如下。(1)本研究共克隆得到2种抗菌肽基因的cDNA序列和基因序列。LEAP-2基因cDNA全长1758 bp,5’-UTR 250 bp、ORF 321 bp、3’-UTR 1187 bp。编码106个氨基酸,包含N端信号肽29 aa,前体肽31 aa,成熟肽46 aa,成熟肽包括4个半胱氨酸,形成2对二硫键。卵形鲳鲹LEAP-2基因全长3096 bp,由3个外显子,2个内含子组成,与哺乳类、鸟类、两栖类、爬行类以及其他硬骨鱼类的LEAP-2基因结构一致。NK-lysin基因cDNA全长731 bp,cDNA ORF 444 bp、编码147个氨基酸,具有保守的鞘脂激活蛋白B结构域和6个保守的半胱氨酸,形成3对二硫键。卵形鲳鲹NK-lysin基因全长1827bp,由5个外显子4个内含子组成,与哺乳类、爬行类、大西洋鲑(Salmo salar)、青鳉(Oryzias latipes)的NK-lysin基因结构一致,而鸟类、红点鲑(Salvelinus alpinus)、大黄鱼(Larimichthys crocea)的NK-lysin基因是由4个外显子和3个内含子组成。卵形鲳鲹LEAP-2基因主要在肝脏中表达,而卵形鲳鲹NK-lysin基因主要在鰓中表达。经美人鱼发光杆菌刺激后,LEAP-2和NK-lysin基因表达量在肝脏、头肾、肠、脾脏等免疫组织中均显著升高。(2)本研究克隆了卵形鲳鲹成熟肽mLEAP-2片段,构建了pET-32a/mLEAP-2表达载体,并在大肠杆菌BL21上清中大量表达。诱导条件为37℃,0.8mm IPTG,220 rpm诱导4小时。克隆了卵形鲳鲹成熟肽mNK-lysin片段,构建了pET-32a/mNK-lysin表达载体,但优化条件后,在大肠杆菌BL21和rossate中仍无法表达。更换载体,构建pGEX-6P-1/mNK-lysin表达载体,成功在大肠杆菌BL21包涵体中表达,诱导条件为18℃,0.1mm IPTG,220 rpm诱导6小时。采用抑菌圈法和微量稀释法检测抑菌活性,发现卵形鲳鲹mLEAP-2、mNK-lysin重组蛋白对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌都具有抑菌活性。(3)本研究克隆LEAP-2启动子转录起始位点前1575 bp,转录起始位点后251 bp,成功构建了卵形鲳鲹LEAP-2启动子5个不同长度缺失片段的荧光素酶报告基因重组质粒(L1,L2,L3,L4,L5),瞬转人293T细胞检测活性,结果显示L3(-659,+251)片段活性最高,为LEAP-2启动子核心区域,对L3上7个预测的转录因子结合位点通过PCR技术进行定点突变,构建了7个点突变荧光素酶报告基因重组质粒,瞬转人293T细胞检测活性,结果显示,USF转录因子结合位点突变后活性显著降低。克隆NK-lysin启动子转录起始位点前854 bp,转录起始位点后40 bp,构建了卵形鲳鲹NK-lysin启动子5个不同长度缺失片段的荧光素酶报告基因重组质粒(N1,N2,N3,N4,N5),瞬转人293T细胞检测活性,结果显示N3(-476,+40)片段活性最高,为NK-lysin启动子核心区域,对N3上7个预测的转录因子结合位点通过PCR技术进行点突变,构建了7个点突变荧光素酶报告基因重组质粒,瞬转人293T细胞检测活性,结果显示C/EBPalp,Oct-1转录因子结合位点突变后,活性显著升高。