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蓝光受体隐花色素(cryptochrome,简称CRY)在拟南芥菜中介导多种光反应,包括抑制下胚轴的伸长、促进子叶的张开、促进花色素苷的积累、调节开花以及调控气孔开放等。番茄、豌豆、苔藓和蕨类植物中也已经发现CRY,但是CRY在单子叶植物中的功能和作用机理目前还不清楚。高粱是单子叶禾本科C4植物,在粮食、饲料和能源生产等方面具有重大的应用价值,但对其隐花色素的功能研究较少。由于目前高粱的遗传转化体系没有建立及鉴于高粱和水稻的亲缘关系较近,拟将高粱的隐花色素基因转到水稻中来研究高粱隐花色素基因的功能。
从http://www.phytome.org下载SbCRY1a(LOC Sb04g023680.1)和SbCRY1b(LOC Sb04g023680.1)基因及其启动子序列。构建SbCRY1a和SbCRY1b基因启动子与GUS基因融合的载体,采用农杆菌介导法侵染水稻胚性愈伤组织。获得的抗潮霉素转基因苗再用GUS引物对其鉴别,对获得的阳性苗分别在白光以及黑暗、蓝光、红光等不同光条件下培养,待植株长至3-5叶期时,分别取植株各部位进行GUS染色,结果发现SbCRY1a-P::GUS在植株颖壳、叶片、茎及茎生长点部位有明显的着色,其它如根、根部成熟区等部位未见明显的GUS染色。黑暗、蓝光、红光等光处理等对GUS染色反应无影响。
SbCRY1b-P::GUS只在植株叶片稍有着色反应,其它部位均无明显的GUS染色反应,且不同光处理对GUS染色反应也无影响。
按照全长目的基因来设计引物,通过PCR克隆得到SbCRY1a全长DNA序列,将这段序列装载到带有组成型启动子Ubi的表达载体pXW上,构建超表达载体。使SbCRY1a基因表达上调,通过观察转基因水稻的生长发育以及在各种光处理下的表型差异来推测该基因的功能。本试验通过观察在自然光及蓝光下处理3-5叶期的转基因苗,处理结果如下:在蓝光条件下,大多数过表达转基因株系表现出不同程度的矮化的表型,过表达SbCRY1a能有效促进花色素苷的积累。
实验结果表明:SbCRY1a主要在植物绿色组织中表达,具有典型的蓝光介导的去黄化反应。SbCRY1b只在叶片中有表达,其它组织中均无表达。自然光、黑暗、蓝光、红光处理对SbCR1a和SbCRY1b的表达无影响。从基因的结构和功能研究结果证实,SbCRY1a和SbCRY16也都是隐花色素基因家族的一员。