论文部分内容阅读
第一部分:肾缺血再灌注损伤和肾小管上皮细胞缺氧/复氧处理诱导XBP1途径相关的内质网应激目的:探索肾缺血再灌注（ischemic reperfusion,IR）和肾小管上皮细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）处理造成的损伤与内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）相关信号通路的关系。方法:将6-8周龄（6-8w）雄性C57BL/6小鼠以每组9只分为2组:（1）假手术组（sham组）:小鼠沿腹部中线开腹,游离左侧肾缔,切除右侧肾脏并关腹;（2）肾缺血再灌注损伤组（IRI组）:小鼠沿腹部中线开腹后,以显微血管夹阻断左侧肾蒂45min后开放,右侧肾脏被切除及关腹。各组6只观察术后14天生存情况。其余小鼠术后24h,获取血液及左侧肾脏组织,血液离心后,收集血清并检测肌酐（Creatinine,CR）和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,Ngal）浓度;肾组织经HE染色观察肾脏病理损伤,DHE染色观察肾脏活性氧（Reactive oxygen species,ROS）产生,免疫组化观察肾脏细胞P53/ATM的表达,TUNEL免疫组化固定观察肾脏细胞凋亡情况,透视电镜观察肾小管上皮细胞内质网超微结构改变,Bi P、CHOP免疫荧光染色和未折叠蛋白反应（Unfolded protein response,UPR）相关蛋白Western印迹实验分析与内质网应激关系。将小鼠肾小管上皮细胞系（TCMK1）分为2组:（1）正常对照组（normal control组）:未做特殊处理;（2）缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）组:进行缺氧/复氧（Hypoxia/reoxygenation,H/R）处理。利用CCK8检测TCMK1细胞活性,通过流式细胞术检测ROS和凋亡率。结果:IRI组小鼠3d内全部死亡,sham组14d生存率100%。IRI组的血CR和Ngal较sham组显著增高。同时,IRI组的肾脏病理损伤情况,活性氧产生,ATM/P53表达,细胞调亡率也均明显增加。透视电镜检测到sham组肾小管上皮细胞内质网无明显肿涨、变形和脱颗粒等退行性改变。相反,IRI组肾小管上皮细胞内质网明显肿涨、变形和脱颗粒。IRI组Bi P和CHOP的荧光密度和所有UPR相关蛋白Western blot相对表达量远大于sham组,并且其中XBP1蛋白表达增加最为明显。相比于normal control组,H/R组TCMK1细胞活性随缺氧时间延长显著下降,ROS产生和细胞调亡率却明显增加。结论:肾脏IRI和TCMK1细胞H/R在体内外均可造成严重的组织细胞损伤,ROS和凋亡增加,破坏机体功能,下调生存率。于此同时,IRI诱导强烈的ERS并显著增加XBP1表达,说明XBP1可能在肾IRI和过程中发挥一定的作用。第二部分:调节XBP1对缺血再灌注损伤肾脏和缺氧复氧处理肾小管上皮细胞影响目的:IRI与ERS和氧化应激密切相关。我们已经发现XBP1可能在肾IRI和TCMK1细胞H/R过程中发挥一定的作用,所以本实验探讨了调节XBP1对IRI肾脏和H/R处理TCMK1细胞的影响。方法:依据XBP1的调节方向对TCMK1细胞分组:（1）正常对照组（normal control组）:未做特殊处理;（2）空白慢病毒对照组（lenti-control组）:转导空白慢病毒;（3）XBP1过表达慢病毒组（lenti-XBP1组）:转导XBP1过表达慢病毒;（4）XBP1表达干扰慢病毒组（lenti-sh RNA-XBP1组）:转导XBP1表达干扰慢病毒。细胞转导对应病毒后,利用RT-PCR和Western blot检测其m RNA和蛋白质的表达情况。对TCMK1细胞进行H/R处理后,依据XBP1的调节方向对TCMK1细胞分组:（1）H/R control组;（2）空白慢病毒H/R组（lenti-control H/R组）:转导空白慢病毒并H/R处理;（3）XBP1过表达慢病毒H/R组（lenti-XBP1 H/R组）:转导XBP1过表达慢病毒并H/R处理;（4）XBP1表达干扰慢病毒H/R组（lenti-sh RNA-XBP1 H/R组）:转导XBP1表达干扰慢病毒并H/R处理。通过CCK8法检测每组细胞活性,流式细胞术检测每组的ROS和凋亡率。依据XBP1的调节方式将6-8w雄性C57BL/6小鼠以每组9只分为2组:（1）野生型（WT）组:小鼠沿腹部中线开腹后,以显微血管夹阻断左侧肾缔45min后开放,右侧肾脏被切除及关腹（2）heterozygous XBP1半敲除组（XBP1+/-组）:基因组一条同源染色体的XBP1被敲除,并给予肾缺血再灌注损伤。各组6只观察术后14天生存情况。其余小鼠术后24h,获取血液及左侧肾脏组织,血液离心后,收集血清并检测CR和Ngal浓度;肾组织经HE染色观察肾脏病理损伤,DHE染色观察肾ROS产生,肾脏损伤分子1（Kidney injury molecule 1,KIM-1）和TUNEL免疫组化观察肾脏损伤和凋亡情况。结果:相比于normal control组的XBP1 m RNA和蛋白质表达量,lenti-control组无显著区别,lenti-XBP1组显著增加,lenti-sh RNA-XBP1组明显下降。lenti-XBP1 H/R组TCMK1细胞的活性下降、ROS产生和调亡率增加较H/R control组更为明显。lenti-sh RNA-XBP1 H/R组的细胞则是活性使明显高于H/R组,ROS和调亡率也明显低于H/R组。XBP1+/-组14d生存率达到66.66%,而且CR与Ngal上升受到明显抑制,肾脏病理损伤情况,活性氧产生,细胞调亡率和KIM-1表达也均明显低于WT组。结论:在IRI或H/R时,上调XBP1加重组织细胞的损伤,促进氧化应激,使肾脏功能和细胞活性下降更多,凋亡增加更显著。与之相反,下调XBP1使损伤减轻,生存率提高,抑制氧化应激,对IRI肾脏和H/R处理的TCMK1起到了保护作用。第三部分:下调XBP1通过减少HRD1介导的NRF2泛素化降解来保护缺血再灌注损伤肾脏目的:XBP1和HRD1是关键的ER应激信号分子。NRF2是抵抗氧化应激的主要转录因子。我们发现,在H/R处理后,XBP1-HRD1的下调和NRF2的上调在减少细胞凋亡、维持增殖和降低ROS方面的作用是一致的。同时,以往研究显示,因为线粒体相关内质网膜（MAM）这一结构的存在,内质网和线粒体和功能是有其内在联系的。所以本实验研究了调节XBP1、HRD1和NRF2的抗IRI作用和潜在机制。方法:依据XBP1的调节方向对TCMK1细胞分组:（1）H/R control组;（2）空白慢病毒H/R组（lenti-control H/R组）:转导空白慢病毒并H/R处理;（3）XBP1过表达慢病毒H/R组（lenti-XBP1 H/R组）:转导XBP1过表达慢病毒并H/R处理;（4）XBP1表达干扰慢病毒H/R组（lenti-sh RNA-XBP1 H/R组）:转导XBP1表达干扰慢病毒并H/R处理。依据HRD1的调节方向对TCMK1细胞分组:（1）H/R control组;（2）阴性si RNA H/R组（si RNA control H/R组）:转染阴性si RNA并H/R处理;（3）阴性plasmid H/R组（plasmid control H/R组）:转染阴性plasmid并H/R处理;（4）HRD1表达干扰H/R组（si RNA-HRD1 H/R组）:转染si RNA-HRD1并H/R处理;（5）HRD1过表达H/R组（plasmid-HRD1 H/R组）:转染plasmid-HRD1并H/R处理。依据NRF2的调节方向对TCMK1细胞分组:（1）H/R control组;（2）DMSO H/R组（DMSO H/R组）:细胞与0.01%DMSO孵育并H/R处理;（3）NRF2表达抑制H/R组（ML385 H/R组）:细胞添加NRF2抑制剂（ML385）孵育并H/R处理;（4）NRF2表达上调H/R组（CDDO-ME H/R组）:细胞添加NRF2激动剂（CDDO-ME）孵育并H/R处理。同时,选取前文所述WT组和XBP1+/-组小鼠肾组织。利用RT-PCR和Western blot检测每组在XBP1、HRD1、NRF2和HO-1的m RNA与蛋白质表达变化。TCMK1细胞经0h、24h和48h缺氧与2h复氧处理后制成细胞爬片,通过HRD1和NRF2的免疫荧光染色和激光共聚焦检测H/R处理后HRD1和NRF2分子的共定位程度变化。HEK-293细胞使用免疫共沉淀研究H/R处理后HRD1和NRF2分子相互作用。使用HEK-293T细胞进行泛素化检测以确定HRD1和NRF2的相互作用关系。最后,利用生物信息学预测HRD1和NRF2相互作用的氨基酸序列并验证。结果:通过Western blot,检测到XBP1正向调节HRD1表达,HRD1在转录水平正向调节NRF2表达,在转录后水平逆向调节NRF2表达。通过免疫荧光、激光共聚焦和免疫共沉淀,检测到HRD1、NRF2在H/R后分子结构相互结合。泛素化测定显示XBP1-HRD1通过NRF2的QSLVPDI氨基酸序列促进NRF2的泛素化并因此加速其降解。结论:XBP1-HRD1-NRF2在在IRI或H/R期间显示出了完整的信号通路。XBP1的下调可以通过降低HRD1的表达来减少NRF2的泛素化降解,从而保护IR肾脏,为肾脏IRI的预防和治疗提供新的靶点。