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热稳定抗真菌因子(Heat stable antifungal factor,HSAF),是产酶溶杆菌C3和OH11代谢产生的一类大环内酯类抗生素,对多种丝状真菌具有抑制活性,具有较好的开发应用前景。梨黑斑病是梨生产上的主要病害之一。由链格孢菌Alternaria alternata引起,其为害梨的叶片与果实,形成叶片与果实的黑色斑点症状,严重影响我国梨的产量与品质。前期,从全国主要的梨产区采集了梨黑斑病样品,并进行了分离鉴定。为明确HSAF对梨黑斑病菌种群的抑制效果及其对梨黑斑病作用机理,本文有以下几个方面结果:1、梨黑斑病菌分离鉴定及供试菌株筛选从全国18个梨产区66份梨黑斑病样品中共分离得到了57株梨黑斑病菌,根据rDNA-ITS、Gpd、RPB2、OPA2和EF1α核苷酸序列将这57株梨黑斑病菌分为3大类,并选出各自代表性菌株,以致病性和对HSAF敏感性为依据,筛选出具有代表性的HN-5作为供试菌株。2、HSAF对梨黑斑病菌HN-5抑制活性测定采用生长速率法测定HSAF对梨黑斑病菌HN-5室内毒力水平,获得HSAF对梨黑斑病菌HN-5的毒力回归方程。HSAF处理HN-5分生孢子时,发现HSAF能够抑制分生孢子萌发L。进一步的研究发现,HSAF处理后的较老的菌丝明显变粗膨胀,菌丝扭曲严重并且菌丝分枝增多,通过细胞壁染色发现HSAF能够抑制菌丝尖端细胞壁的合成,同时细胞核染色发现HSAF处理后的菌丝细胞核消失,细胞发生凋亡。3、HSAF对梨黑斑病菌田间药效试验开展HSAF对梨黑斑病菌田间药效试验,武汉梨园的结果表明:喷施HSAF防治效果与对照不喷药相比,病情指数从19.13下降到1.33,翠冠梨上病情指数从13.89下降到2.06,而且相较于常规农药10%苯醚甲环唑可湿性粉剂3000倍液,HSAF的防治效果也要好。重庆梨园的HSAF防治效果也要优于对照代森锰锌药剂。4、HSAF对梨黑斑病菌作用分子机制初探为明确HSAF的作用分子机理,对HSAF处理的梨黑斑病菌(处理组)与野生型(对照组)的进行转录组测序分析,对这些差异表达基因进行GO与KEGG富集分析,发现HSAF处理后,代谢过程、催化活性和膜相关基因、氨基酸代谢、药物代谢和三羧酸循环和碳代谢大量下调表达。对代谢途径与信号传导途径相关基因进一步分析,发现碳代谢途径中的关键基因下调表达,推测HSAF可能阻断糖酵解途径和三羧酸循环,导致菌丝的有氧呼吸被抑制,影响细胞内糖的代谢与能量的获取。与碳代谢相对应的是,大多数氮代谢相关基因也呈下调表达模式。进一步分析发现氮代谢与炭代谢关联的信号通路如鞘脂代谢途径和AMPK信号传导途径响应HSAF对黑斑病菌的毒性。5、梨黑斑病菌遗传转化体系建立通过对原生质体制备条件与转化方法的优化,建立了梨黑斑病菌遗传转化体系:梨黑斑病菌HN-5在MR培养基中培养36 h,收集菌丝在酶解液(1%崩溃酶+1%裂解酶+1%纤维素酶+1%蜗牛酶)中酶解3 h,离心收集原生质体,用稳渗剂(0.7 mol/L NaCl+0.8 mol/L Mannitol)清洗原生质体,再用STC Buffer重悬浮原生质体用于转化;将2μg的质粒转入梨黑斑病菌,共获得12个转化子,成功建立梨黑斑病菌PEG介导的原生质体转化体系。