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近年来大量文献报道:表观遗传酶组蛋白赖氨酸去甲基化酶1(LSD1)在胃癌、肺癌等肿瘤中高表达。靶向LSD1特异性抑制剂可抑制癌细胞增殖,调控基因转录抑制或者激活,并在DNA损伤修复中起重要作用。本研究旨在探索在胃癌细胞中靶向抑制LSD1的活性对DNA损伤类药物阿霉素抗肿瘤的增敏作用及其分子机制。另一方面,PD-1是一个主要表达在活化T细胞上的抑制性受体,与其配体PD-L1结合可显著抑制T细胞的活化和增殖,使肿瘤细胞逃避机体的免疫监控和杀伤。在非小细胞肺癌(NSCLCS)中存在PD-L1和LSD1异常表达,靶向PD-1和PD-L1的抗体类药物也已经证实起到良好的抗肿瘤效果。因此,本研究也同时探索在NSCLCS中PD-L1的转录表达是否受LSD1的表观调控。本课题的主要研究内容及结果如下:第一部分:LSD1的活性抑制对DNA损伤类药物阿霉素的抗肿瘤增敏作用及其分子机制1.MTT法检测细胞增殖结果显示:LSD1的抑制剂GSK-LSD1 2HCL、C26和SP2509均可明显抑制MGC-803细胞的增殖。提示LSD1的活性抑制可抑制胃癌细胞的增殖。2.流式细胞术分析细胞周期结果显示:在MGC-803和SGC-7901细胞中LSD1的不可逆性抑制剂GSK-LSD1 2HCL和SP2509均不影响细胞的周期进程,而本课题组设计的LSD1的不可逆抑制剂C26对细胞周期有一定的阻滞能力。进一步在MGC-803细胞中用si RNA靶向降低LSD1的表达,结果也不影响细胞的周期进程,提示LSD1活性抑制不影响胃癌细胞的周期进程。3.将LSD1的抑制剂2-PCPA与阿霉素(DOX)、5-Fu和顺铂等DNA损伤类药物联用的结果显示:联用组均比单用组能更明显的抑制细胞的增殖,其中2-PCPA与低剂量的DOX联用组的效果较好。4.LSD1的特异性抑制剂GSK-LSD1 2HCL与阿霉素(DOX)在细胞水平上的联用结果显示:在MGC-803和HGC-27细胞中,联用组均能显著上调促凋亡蛋白Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase3和BAX的表达,而下调抗凋亡蛋白BCL-2的表达。进一步在MGC-803细胞中用si RNA靶向降低LSD1的表达后与DOX联用,结果仍显示联用组比单用组促凋亡蛋白Cleaved-PARP的表达增多,由此提示LSD1的活性抑制可能通过线粒体介导的内源性凋亡通路激活增敏DOX的促细胞凋亡的能力。5.LSD1的特异性抑制剂GSK-LSD1 2HCL与阿霉素(DOX)在整体动物水平上的的联用显示:联用组比单用组的瘤体积和瘤重量明显减小,且Western blot显示联用组比单用组促凋亡蛋白Cleaved-PARP的表达增多,提示体内LSD1的活性抑制也可以增强DOX的抗肿瘤活性。第二部分:LSD1对非小细胞肺癌中PD-L1的表达及其非免疫学功能的调节1.流式细胞术和Western blot的结果均可检测到NSCLCS细胞系中PD-L1表达,其中在H1975细胞中的表达明显高于其它细胞;同时还发现在H1975细胞中LSD1的表达也明显高于其它细胞,结果提示在非小细胞肺癌中PD-L1的表达与LSD1的表达可能存在一定的相关性。2.抑制LSD1的活性可显著降低H1975细胞中PD-L1的表达,且呈剂量依赖性和时间依赖性。用LSD1的si RNA靶向沉默LSD1后,PD-L1的蛋白表达量明显降低。用IFNγ预先上调PD-L1的表达水平后,抑制LSD1的活性依然可剂量依赖性和时间依赖性降低PD-L1的蛋白表达。提示LSD1活性抑制可显著下调PD-L1的蛋白表达水平,且不受肿瘤微环境的影响。3.无论是否存在IFNγ,抑制LSD1的活性均可显著降低H1975细胞中PDL1的m RNA水平。结果还显示无论是否存在IFNγ,LSD1的活性抑制均可显著降低IFNGR1的蛋白表达和m RNA水平。进一步研究发现,抑制LSD1的活性还可抑制干扰素受体介导的信号通路的活化,降低p-JAK2和p-JAK3的蛋白表达。此外,还发现抑制LSD1的活性可以通过促进P53的表达,进而抑制PD-L1的表达。4.慢病毒转染沉默PD-L1的H1975细胞与对照组相比不易发生EMT过程,且细胞的增殖、迁移和划痕修复能力降低。在H1975细胞中抑制LSD1的活性,细胞的EMT过程则不易发生,细胞的划痕修复能力降低。综上所述,LSD1的活性抑制可抑制胃癌细胞的增殖并可显著增强肿瘤细胞对DOX的敏感性。LSD1可通过调节干扰素受体IFNGR1及干扰素受体介导的信号通路和P53,调节H1975细胞中PD-L1的蛋白表达以及与肿瘤细胞相关的PD-L1的非免疫学功能。