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免疫分析法(Immunoassay)是一类较为新型、以抗原.抗体特异反应为基础的快速筛选分析方法。该法灵敏度较高,特异性强,与仪器法相比,无需昂贵的仪器和专业分析人员,样品处理过程相对简单,因此检测花费较低,而且检测快速,检测仪器较为简单便宜,有的仪器较小,方便携带。目前免疫分析法已广泛应用于兽药残留或其它食品中有害残留的快速现场筛选试验。
本研究将从新方法和新应用两方面探讨免疫分析法在食品有害残留和新药筛选领域的应用前景。
在现有的食品有害残留快速检测的报道中,免疫分析法多为非均相反应体系,为了将标记的抗原/抗体与游离抗原/抗体分离,操作过程中固定相需要多次洗涤,溶剂使用量较多、耗时较长,本研究将建立一种均相的荧光偏振免疫分析方法(Fluorescence polarization immunoassay,FPIA),该法是一种快速简便高效的分析方法,无需昂贵复杂的仪器,测定时间很短,数分钟即可完成检测。
本研究以喹诺酮类药物,沙拉沙星为检测药物,利用异硫氰酸荧光素标记沙拉沙星合成荧光标记物,采用薄层色谱法提纯,优化了反应时间、标记物和抗体的工作浓度,建立了沙拉沙星的快速荧光偏振免疫分析检测法。经检测,该方法测定沙拉沙星在缓冲液中的半数抑制浓度(IC50)为43.23 ng/mL,检测范围为5.7~327.6 ng/mL,可以达到国家规定的动物性食品中兽药最高残留限量(80μg/kg)的要求。同时本研究考察了FPIA测定沙拉沙星时检测值的稳定性与孵育时间的关系,以及沙拉沙星对其它4种喹诺酮类药物的交叉反应。结果显示:此法测得沙拉沙星抗体与环丙沙星、恩诺沙星、加替沙星、氧氟沙星的交叉反应率分别为3.3%,1.8%,1.7%,0.7%。在牛奶和猪尿中沙拉沙星的回收率分别在71%~94%、74%~102%之间。该法操作简单快捷,整个检测过程只需5 min,为动物性食品中沙拉沙星残留的快速筛选检测提供了一种准确、高效的选择。
另外,本研究将利用表观遗传学过程建立免疫分析法,检测甲基转移酶活性,目的是应用于新药筛选。本研究将针对甲基转移酶催化的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)-S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)反应,测定反应产物和起始物的浓度变化来检测各种分子对甲基化转移酶活性的影响,从而建立一种可以用来高通量筛选潜在药物的手段。目前S-腺苷-L-高半胱氨酸浓度的检测方法较少,其中比色法主要缺点是步骤繁琐费时,而免疫分析法则操作简单快速,成本较低。本研究合成并鉴定了S-腺苷-L-高半胱氨酸的多种免疫原和包被原,为检测S-腺苷-L-高半胱氨酸的免疫分析法的建立奠定了基础。最后,本研究还将建立苯甲酸类防腐剂的免疫分析法,经鉴定,成功合成了苯甲酸的免疫原和包被原,为检测苯甲酸的ELISA方法学建立奠定了基础。