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凋亡(apoptosis),也可以称为细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)。诱导凋亡的途径包括死亡受体和线粒体途径;而内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)诱导的细胞凋亡逐渐被认识,其在多种心血管疾病的发生和发展过程中发挥着重要作用。因此抑制ERS,减轻凋亡可能是治疗心血管疾病的新策略。凋亡的早期阶段伴随着细胞持续性的皱缩,即凋亡性容积减小(apoptotic volume decrease,AVD)。大量的研究表明,Cl-外流以及伴随的水外流导致的AVD是细胞凋亡的重要前提,并且早于caspases的激活;而阻断氯离子通道减轻了AVD,并且可以抑制细胞凋亡。本实验拟在衣霉素通过ERS途径诱导心肌细胞凋亡的模型上,观察氯通道阻断剂DIDS对心肌细胞凋亡的影响,并初步探讨其机制。研究目的1.原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,应用经典的内质网应激凋亡诱导剂Tunicamycin(Tm)构建心肌细胞凋亡模型。2.Tm诱导心肌细胞凋亡过程中,观察氯离子通道阻断剂DIDS对心肌细胞存活及凋亡的影响。3.初步探讨氯离子通道阻断剂DIDS对Tm诱导的心肌细胞凋亡的影响机制。实验方法1.实验分为阴性对照组,阳性对照组(Tm组)及实验组(Tm+DIDS),以及单独应用DIDS组。2.四唑盐(MTT)比色法观察心肌细胞的存活率;流式细胞术(Anexin v/PI)反映心肌细胞凋亡程度。3.免疫印迹方法测定Tm诱导心肌凋亡过程中靶分子GRP78、CHOP蛋白水平的变化。4.氯离子通道阻断剂DIDS干预对Tm处理的心肌细胞存活率、细胞凋亡率及伴侣分子GRP78、信号分子CHOP水平的变化。实验结果1.与阴性对照组相比,衣霉素(Tm)组心肌细胞存活率显著下降,并呈现与Tm的剂量与作用时间正相关(P<0.05,n=12);Tm的最佳诱导浓度为100ng/ml,作用时间为72h。2.通过MTT比色法和流式细胞术来判断心肌细胞死亡的性质。当Tm浓度为100ng/ml,作用72h时,心肌细胞存活率和凋亡率分别为57.4±3.2%(n=12),25.9±5.8%(n=6)。提示Tm导致心肌细胞死亡的主要方式是凋亡性死亡。3.Tm作用于心肌细胞后,内质网应激蛋白GRP78和CHOP表达于6h开始增加,24h达到峰值,随后呈下降趋势。4.与Tm组相比,Tm加DIDS组的细胞存活率较Tm组显著增加,二者分别是57.4±3.2%和80.4%±4.2%(P<0.05,n=12)。5.与Tm组相比,Tm加DIDS组的细胞凋亡率较Tm组显著降低,二者分别是25.9±5.8%和14.3%±2.9%(P<0.05,n=6)。6.Tm处理心肌细胞24h后,细胞内的GRP78、CHOP水平分别为阴性对照组的3倍和6.5倍,有显著的统计学差异(P<0.05,n=6)。而Tm加DIDS共同处理心肌细胞时,细胞内的GRP78、CHOP表达水平显著降低(P<0.05,n=6)。结论1.成功构建Tm诱导心肌细胞内质网应激凋亡模型,Tm的最佳诱导浓度为100ng/ml,作用时间为72h。2.氯离子通道阻断剂DIDS能够显著抑制Tm诱导的心肌细胞凋亡的发生,具有明显的减轻内质网应激性心肌细胞的损伤。3.氯离子通道阻断剂DIDS明显抑制Tm诱导心肌细胞凋亡的主要机制可能与抑制GRP78、CHOP水平的表达,减轻了内质网应激发生有关。