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鸡呼肠孤病毒感染是由禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)引起的一种以鸡瘫痪及跗关节肿胀为临床特征的传染性疾病。该病传播速度快、发病范围广,不同日龄、不同品种的鸡均可感染,尤其对商品肉鸡的危害最为严重。感染鸡发病初期主要表现为体温升高、精神沉郁、食欲废绝及营养吸收不良等,随着病程的发展,逐渐出现关节肿胀、发炎,卧地倦动,跛行等症状;剖检可见关节腔内纤维素性渗出,腱鞘炎,肌腱断裂等典型的病毒性关节炎症状,给我国养鸡业造成了严重的经济损失,加强该病的研究对促进我国养鸡业的健康发展具有重要意义。而本研究从疑似ARV感染的患鸡肌腱中分离到一株ARV,对分离的毒株进行了序列分析及致病性研究,利用建立的荧光定量RT-PCR方法对病毒在感染鸡不同组织器官中的分布、排毒规律及病毒血症情况进行了监测,为ARV的防控提供了理论依据。本研究首先采用SPF鸡胚与鸡胚肝细胞两种分离方式对山东临沂地区疑似ARV感染的关节病料进行病毒分离,通过RT-PCR检测、序列测定与分析、动物回归等试验对病毒分离株进行鉴定。病毒感染SPF鸡胚能导致鸡胚死亡,胚体卵黄囊破裂,死亡时间集中在接种后72~96h;感染鸡胚肝细胞能导致细胞出现以融合为特征的病变,与报道的ARV特性相符。RT-PCR鉴定结果显示,扩增产物与预期大小一致。σC基因同源性分析结果显示,该分离株与Reo/PA/Broiler/15511/13分离株的同源性最高,核苷酸同源性为95.2%,氨基酸同源性为92.2%,但与标准株1733和S1133的同源性较低,核苷酸同源性分别为51.3%和51.2%,氨基酸同源性均为29.6%。动物回归试验显示,1日龄健康罗斯308肉雏鸡感染该毒株后其临床症状及剖检变化与自然感染病例一致。以上试验表明,该分离株为ARV,命名为383株。根据ARV全基因序列设计一条特异性探针及引物,扩增长度为93bp。将扩增的目的片段连接到p MD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,倍比稀释质粒作为标准品,用优化的反应条件构建标准曲线,建立检测ARV的Taq Man探针荧光定量RT-PCR方法。该方法的标准曲线线性关系良好,线性回归方程为y=-3.361x+45.635,相关系数R2=0.9958;特异性良好,仅能检测ARV,无交叉反应现象;敏感性良好,最小检出模板浓度约为10Copies/μL,是普通PCR的1000倍;重复性良好,批内、批间变异系数均小于0.5%。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可用于ARV的临床检测。160只1日龄健康罗斯308肉雏鸡随机分为4组,每组40只。1~3组分别以脚垫接种、点眼滴鼻和腿部肌肉接种三种方式,人工感染分离的383株,每只接种0.1m L 5倍稀释的病毒液(ELD50为10-5.53/0.2m L),对照组设40只雏鸡,每只接种0.1m L无菌生理盐水。观察试验肉鸡的发病情况、临床症状等,每隔2d采集各组泄殖腔棉拭子及抗凝血3份,用于检测肉鸡的排毒情况及病毒血症情况。于感染后4、8、12、16、20、24、28d每组剖杀3只,称重后取各组织器官制备石蜡切片,观察其组织病理学变化,同时收取各组织进行病毒载量的测定,取脾脏、胸腺、法氏囊称重,测定免疫器官指数。于感染后4、8、12、16、20、24、28d采集每组非抗凝血3份,测定血清中生化指标和ARV抗体水平。结果显示,试验组肉鸡均有不同程度关节肿胀、出血的关节炎症状以及肠道出血的肠炎症状,其中脚垫接种组症状最为严重,点眼滴鼻组最轻;试验组肉鸡的体重增长缓慢,以脚垫接种组最为显著;胸腺指数略高于对照组,脾脏和法氏囊指数变化不明显;间接ELISA检测结果显示,试验组ARV抗体水平基本无明显变化,但较对照组稍高;血液生化指标结果显示,血清中谷丙转氨酶的含量升高最为明显,其他指标无显著变化;棉拭子排毒规律结果显示,三组均在感染初期出现排毒;病毒血症结果显示,人工感染383株不引起肉鸡的病毒血症;病毒组织载量结果显示,人工感染383株仅感染初期在法氏囊、胰腺及十二指肠组织中检测到病毒。综上,人工感染383株可引起肉鸡的病毒性关节炎、肠道疾病以及生长抑制等。