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目的:
鉴于人类肿瘤相关基因PAX6在视网膜的胚胎发育过程中发挥关键的调节作用,本研究观察PAX6过表达对人类视网膜母细胞瘤细胞增殖的影响,探讨其可能的发生机制,以期发现视网膜母细胞瘤新的特异性分子治疗靶点。
材料与方法:
构建PAX6过表达慢病毒载体,分别使用空白慢病毒载体和PAX6-GFP慢病毒载体感染人类视网膜母细胞瘤细胞系Y79和SO-Rb50细胞,即为阴性对照慢病毒载体组和PAX6过表达组。同时,将常规培养条件下的两株视网膜母细胞瘤细胞系细胞作为未转染组。应用实时定量聚合酶链式反应(Real-timePCR)和蛋白质免疫印迹杂交技术(Westernblot)检测PAX6-GFP慢病毒载体感染后细胞内PAX6过表达情况。应用CCK-8法检测PAX6过表达前后细胞增殖率的变化;流式细胞术检测细胞周期的改变;TUNEL法检测细胞凋亡率的变化。应用Westemblot技术检测细胞周期调控蛋白p53、p21、p27、cdc2、增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞凋亡相关蛋白活化caspase-3相对表达量的变化。
结果:
一、慢病毒载体感染效率检测结果
慢病毒载体感染两株视网膜母细胞瘤细胞系Y79和SO-Rb50细胞3天后,应用荧光显微镜观察并比较各组细胞明视野和荧光视野内报告基因——绿色荧光蛋白(GFP)阳性表达细胞百分率,估算细胞转染效率。当病毒感染复数为20时,可见两株视网膜母细胞瘤细胞系阴性对照慢病毒载体组和PAX6过表达组细胞转染效率约为80%。
二、视网膜母细胞瘤细胞内PAX6稳定过表达情况
慢病毒载体感染两株视网膜母细胞瘤细胞系细胞5天后,可见PAX6过表达组细胞内PAX6mRNA相对表达量分别为667.8±12.2和10.4±1.0,较阴性对照慢病毒载体组(1.00±0.06和1.00±0.07)和未转染组(0.10±0.05和1.08±0.07)明显上升(P<0.001)。同时,两株视网膜母细胞瘤细胞系过表达组PAX6蛋白表达水平显著上升。
三、体外培养的视网膜母细胞瘤细胞PAX6表达后细胞增殖速度加快
慢病毒载体感染两株视网膜母细胞瘤细胞系细胞3天后,可见PAX6过表达组细胞增殖速度明显加快,尤以Y79细胞为著。取生长曲线对数生长期3个时间点计算细胞存活率,可见第48、72和96小时,Y79细胞系PAX6过表达组细胞存活率依次为143.2%±0.6%、159.1%±0.5%和151.8%±1.2%,较阴性对照慢病毒载体组(103.5%±0.9%、106.0%±0.5%和106.7%±0.5%)明显升高(P<0.001)。另外,第96、120和144小时,SO-Rb50细胞系PAX6过表达组细胞存活率依次为117.1%±1.7%、124.2%±1.6%和126.6%±1.1%,较阴性对照慢病毒载体组(107.9%±1.3%、101.3%±1.3%和100.7%±1.7%)明显升高(P<0.001)。
四、体外培养的视网膜母细胞瘤细胞PAX6过表达后细胞周期变化情况
慢病毒载体感染两株视网膜母细胞瘤细胞系细胞7天后,应用流式细胞术检测细胞周期结果提示PAX6过表达组GO/G1期细胞比率分别为47.6%±0.7%和60.2%±0.3%,较阴性对照慢病毒载体组(57.1%±0.3%和70.1%±0.5%)和未转染组(57.5%±0.6%和69.8%±0.7%)明显下降(P<0.001);而G2/M期细胞比率分别为22.9%±0.3%和12.1%±0.7%,较阴性对照慢病毒载体组(13.4%±0.5%和8.7%±0.7%)和未转染组(12.8%±0.1%和9.2%±0.6%)明显升高(P<0.01)。另外,结果提示SO-Rb50细胞系PAX6过表达组S期细胞比率为27.7%±0.5%,较阴性对照慢病毒载体组(21.2%±1.1%)和未转染组(21.1%±0.3%)明显升高(P<0.001)。此外,两株视网膜母细胞瘤细胞系PAX6过表达组细胞p53、p21蛋白表达水平显著下降,尤以Y79细胞系细胞为著;p27蛋白表达水平稍下降;cdc2蛋白表达水平升高。然而,PCNA蛋白表达水平未见明显变化。
五、体外培养的视网膜母细胞瘤细胞PAX6过表达后细胞凋亡率下降
慢病毒载体感染两株视网膜母细胞瘤细胞系细胞7天后,应用TUNEL法检测细胞凋亡结果提示两株视网膜母细胞瘤细胞系PAX6过表达组细胞凋亡率分别为0.04%±0.03%和0.0%±0.0%,较阴性对照慢病毒载体组(0.60%±0.03%和0.40%±0.04%)和未转染组(0.26%±0.05%和0.37%±0.02%)明显下降(P<0.001)。此外,两株视网膜母细胞瘤细胞系PAX6过表达组活化caspase-3蛋白表达水平显著下降。
结论:
PAX6-GFP慢病毒载体介导的人类视网膜母细胞瘤细胞内PAX6过表达,可导致肿瘤细胞增殖速度加快和caspase-3依赖的细胞凋亡率下降。此外,人类视网膜母细胞瘤细胞内PAX6基因过表达可导致肿瘤细胞周期负向调控分子p53、p21和p27蛋白表达水平下调以及细胞周期正向调控分子cdc2蛋白表达水平上调。进一步推论认为,体外培养的人类视网膜母细胞瘤细胞内PAX6表达可部分解除肿瘤细胞内p53/p21依赖的G0/G1期阻滞,并可通过激活细胞周期正向调控分子cdc2,促进细胞内p53依赖的G2/M期阻滞,提示PAX6基因过表达可促进人类视网膜母细胞瘤增殖,PAX6可能成为视网膜母细胞瘤新的特异性分子治疗靶点。