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L-鸟氨酸是一种重要的化学物质,经常被广泛用作食品,药品生产中的添加剂,并因其在保肝,护肝的功能而被广泛得知。钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)作为谷氨酸棒杆菌的一个亚种,常被用于代谢改造构建高产L-精氨酸的出发菌株。本研究利用钝齿棒杆菌SYPA5-5为出发菌株,敲除L-鸟氨酸到L-精氨酸的下游合成途径,引入外源线性乙酰化途径,显著提高了L-鸟氨酸的高产;同时通过敲除大肠杆菌中L-鸟氨酸的下游代谢途径,串联表达L-谷氨酸到L-鸟氨酸的代谢途径中的编码基因,构建的重组大肠杆菌可过量积累L-鸟氨酸,主要结果如下:一、利用pK18mobsacB敲除质粒,将钝齿棒杆菌中N-乙酰鸟氨酸氨甲酰转移酶(OTCase)编码基因argF进行敲除,实现L-鸟氨酸的过量积累,摇瓶发酵72 h后,L-鸟氨酸的产量达到4.2 g/L。argJ编码N-乙酰鸟氨酸乙酰转移酶(OATase)为L-鸟氨酸合成关键酶,摇瓶发酵重组钝齿棒杆菌Cc-QF-2表明过量表达OATase并不能有效的提高L-鸟氨酸的产量(5.9 g/L),这是由于OATase受产物反馈抑制,通过多氨基酸序列比对和蛋白结构分析,选取OATase中T150,M176位点进行饱和突变反馈抑制得到缓解,但其比酶活也显著降低,原因是该位点既为产物结合位点同时也是底物结合位点。二、人工构建线型鸟氨酸合成途径,将来源大肠杆菌N-乙酰谷氨酸合酶(NAGS)编码基因argA进行克隆表达,并通过定点突变解除L-精氨酸对NAGS的反馈抑制,EcNAGS比酶活为50.4 U/mg,最适pH为8.0,最适温度为37℃。同时从四种不同来源的N-乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(NAOD)中筛选出来源粘质沙雷氏菌的NAOD。SmNAOD的比酶活最高为580.5 U/mg,最适pH为7.0,最适温度为37℃。将EcNAGS与SmNAOD在钝齿棒杆菌中串联表达,对其RBS优化。将重组质粒导入出发菌株CcQF-1中,得到重组菌Cc-QF-4,摇瓶发酵72 h后,L-鸟氨酸的产量达到12.6 g/L,相比于出发菌株Cc-QF-1产量提高3倍,生产强度为0.175 g/L/h。将重组钝齿棒杆菌进行5-L发酵罐研究,发酵到60 h时,Cc-QF-4的产L-鸟氨酸能力为40.4 g/L,相比于Cc-QF-2,Cc-QF-1的产量,分别提高28.2%,41.8%,生产强度达到0.683 g/L/h,并且糖酸转化率为0.269 g/g。三、对E.coli BL21(DE3)进行代谢改造产L-鸟氨酸的研究,发现敲除argI,speF,speC三个基因,使得大肠杆菌EC-O-0能够积累L-鸟氨酸,通过36 h摇瓶发酵测得L-鸟氨酸产量为0.35 g/L。利用Gibson无缝串联技术,将线性化途径中,L-谷氨酸到L-鸟氨酸的五个基因argABCDE以及循环途径中的四个基因argCJBD进行串联表达,分别将重组质粒转化至EC-O-0中分别得到EC-O-5/EC-O-6菌株,并对其产酸能力进行考察。发酵36 h后,L-鸟氨酸的产量分别达到4.28 g/L,4.71 g/L。